糖尿病是一种慢性代谢性疾病，2型糖尿病是主要类型，由于胰岛素分泌不足导致餐后高血糖，进而可能引发心脑血管疾病等并发症。淀粉作为主要的碳水化合物来源，其快速消化与2型糖尿病正相关，因此减慢淀粉消化速度对控制餐后血糖至关重要。芦荟大黄素作为一种具有多种药理作用的天然生物活性化合物，已被证实能激活糖原合成通路以降低血糖，并可能通过抑制特定信号通路减缓糖尿病肾病症状。然而，尽管芦荟大黄素具有潜力，其在糖尿病治疗中的全面效果和安全性仍需进一步研究以弥补现有治疗方法的不足。
安徽中医药大学药学院的秦朝凤、陈乃东教授和皖西学院生物与制药工程学院的李姣研究拟系统探究芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果和抑制机制。主要采用酶抑制动力学、紫外光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、荧光猝灭等多种手段，从体外分子水平探究芦荟大黄素抑制α-葡萄糖苷酶的作用机理，并探究芦荟大黄素与阿卡波糖的联合抑制作用效果，为进一步开发利用芦荟大黄素作为调节人体血糖的保健食品配方提供实验依据。
如图1所示，在一定质量浓度范围内，芦荟大黄素和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果均随着质量浓度增加明显增强。由Origin非线性拟合得到芦荟大黄素的半抑制浓度（IC50）值为75.97 μg/mL，而阿卡波糖IC50为338.84 μg/mL。以上结果表明，芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖更强，对α-葡萄糖苷酶有更好的抑制作用。
如图2a所示，Lineweaver-Burk双倒数图中所有直线交于第3象限。随着芦荟大黄素质量浓度的增加，横截距越小、纵截距均越大，即Vmax和Km均呈下降趋势，此结果说明芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶抑制类型是一种非竞争与反竞争的混合型抑制。由图2b、c可知，抑制剂与α-葡萄糖苷酶作用的解离常数Ki值为88.78 μg/mL，而抑制剂与α-葡萄糖苷酶-PNPG的复合物作用的解离常数K'i值为25.90 μg/mL，说明芦荟大黄素更倾向于与α-葡萄糖苷酶-底物复合物结合。详细的动力学参数如表1所示。![]()
紫外-可见吸收光谱法是一种可以简单、快速、准确地评价在抑制剂作用下，酶的结构及复合物形成的一种新方法。α-葡萄糖苷酶在280 nm波长处有一特征吸收峰，是由于其芳香族氨基酸发生π→π*跃迁所引起的。由图3可以看出，α-葡萄糖苷酶的紫外吸收峰在没有或存在芦荟大黄素时存在显著差异。随着芦荟大黄素质量浓度的增加，特征峰的位置并没有显著地移动，但α-葡萄糖苷酶的吸收峰强度大幅增加，吸收峰强度变化具有浓度依赖性，这说明芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶之间存在相互作用，形成了新的复合物。该现象表明α-葡萄糖苷酶-芦荟大黄素复合物的形成可能会有利于分子间和分子内聚集，破坏Trp和Tyr芳香族氨基酸残基的微环境空间结构，可能导致酶的构象变化和疏水基团的暴露。
红外光谱分析是研究芦荟大黄素诱导α-葡萄糖苷酶结构变化的重要手段。蛋白质的FTIR由几个特征吸收峰组成，包括N—H拉伸振动（3 300～2 070 cm-1）峰，酰胺 I 键 （ 1 700 ～ 1 600 cm -1）、酰胺 I I 键（1 600～1 500 cm-1）和酰胺III键（1 400～1 200 cm-1）特征峰。据报道，酰胺I键（C＝O拉伸振动）对蛋白质二级结构的变化比其他键更敏感。因此，为了进一步确定化合物对α-葡萄糖苷酶的影响，使用FTIR仪检测样品的酰胺I键特征峰。如图4所示，在芦荟大黄素的存在下，α-葡萄糖苷酶的特征峰数量没有增加，说明酶与抑制剂相互作用过程中没有形成新的共价键。另一方面，在α-葡萄糖苷酶溶液中加入芦荟大黄素后，酰胺I键的吸收峰强度明显增加，且酰胺I键由1 654.58 cm-1蓝移到1 650.11 cm-1，表明芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶发生了相互作用并对其构象产生了影响。荧光光谱法常被用于研究蛋白质与小分子之间的相互作用。因为含有Trp、Tyr和Phe等芳香族氨基酸，所以α-葡萄糖苷酶会产生一种内源性荧光，而荧光的强度和位置与这些芳香族氨基酸残基所处的微环境有着紧密的联系。如图5所示，当激发波长为280 nm时，α-葡萄糖苷酶的最大发射特征峰位于340 nm处，随着芦荟大黄素的加入（0～140 μg/mL），该体系的荧光强度降低，但最大发射波长并无明显变化，这说明芦荟大黄素能够通过与酶的相互作用强烈地猝灭α-葡萄糖苷酶的固有荧光，且使其芳香族氨基酸残基的微环境发生变化。
从图6a可以看出，芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶荧光强度的线性关系良好。由表2可知，Ksv值随着温度的升高而减小，由2.101×103 L/mol降低至1.755×103 L/mol；Kq值远大于生物大分子的最大散射碰撞猝灭常数2.0×1010 L/（mol·s），其值均大于1.5×1011 L/（mol·s），说明芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭不是动态碰撞引起的，而是通过酶-配体复合物的形成引起的静态猝灭。![]()
6 芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的热力学参数及相互作用力类型的判断
为了进一步确定芦荟大黄素与α -葡萄糖苷酶的相互作用机制，可以通过式（5）计算确定结合常数（Ka）和结合位点数（n），结果如图6b所示。由表2可知，随着温度的升高，结合常数Ka也随之增加，由于1.898×102L/mol增加3.927×105L/mol，说明温度越高，芦荟大黄素与酶结合的亲和力越强，即芦荟大黄素与酶形成的复合物稳定性提高；同时，结果表明在大部分温度下芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的相互作用位点趋向于1。
根据van’t Hoff公式计算ΔH0、ΔS0及ΔG0的变化，从而确定芦荟大素对α-葡萄糖苷酶的作用力。配体与蛋白质之间的非共价相互作用力一般有4 种类型，即静电相互作用、氢键、范德华力和疏水相互作用。如表2所示，Δ G0为负值，证明了芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的相互作用是一个自发的过程。而ΔH0为452.03 kJ/mol，ΔS0为1.562 kJ/（mol·K），表明其相互作用力主要是疏水相互作用。7 芦荟大黄素与阿卡波糖联合抑制α-葡萄糖苷酶的作用分析
许多研究表明，两种或两种以上的抑制剂联合使用可以协同抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本研究采用报道的方法计算组合作用的类型，根据联用后α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vab与预期的α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vc的差值判断，差值在－0.1以下为协同作用，在－0.1和0.1之间的值为相加作用，相应结果见表3。芦荟大黄素与阿卡波糖组合的Kab－Kc值范围均在－0.1以下，表明芦荟大黄素与阿卡波糖低质量浓度和高质量浓度的组合对α-葡萄糖苷酶的活性均具有协同抑制作用，即芦荟大黄素与阿卡波糖的结合可以增强对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此，可以推测出芦荟大黄素与阿卡波糖联用时，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于单一抑制剂，能有效地提高抑制能力并降低阿卡波糖的不良反应。
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α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病的治疗靶点，其抑制剂可以通过阻碍膳食碳水化合物的消化，将餐后血糖维持在正常水平。从天然产物中寻找抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效药物对调节血糖浓度和控制餐后高血糖具有重要意义。本实验以蒽醌化合物中的芦荟大黄素为研究对象，发现其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于阿卡波糖。研究可知芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶抑制类型是非竞争与反竞争的混合型抑制，其抑制类型与阿卡波糖不同。Zheng Yuxue等通过红外光谱、圆二色光谱和荧光光谱研究阿魏酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制机理，证实了阿魏酸与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶以非共价键结合，猝灭其固有荧光强度，并证实随着阿魏酸的加入，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的二级结构发生改变。沈荷玉等采用紫外光谱和圆二色光谱分析表明，没食子酸的加入导致酶构象发生变化，荧光光谱结果表明没食子酸以静态猝灭的方式强烈猝灭酶的内源性荧光，改变氨基酸残基Trp和Tyr所处的微环境。本实验也采用多种光谱分析方法研究芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的抑制机理。首先运用紫外光谱法初步分析蛋白质分子构象，得出芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶之间形成一种新的复合物。再运用红外光谱法得出芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶发生相互作用使其构象发生改变。最后利用荧光光谱法深入探究两者的作用机制，其结果表明芦荟大黄素通过静态猝灭的方式猝灭α-葡萄糖苷酶的内源性荧光，且结合方式以疏水作用力为主。单药大剂量的使用常常会产生多种不良反应或药物抗性，而将两种或两种以上具有协同治疗作用的药物组合使用时，可明显降低药物的剂量和毒性。联合用药所产生的协同效果一般具有以下的优势：在显著增加治疗效果的同时，可以减少药物使用的剂量，即能够增加或保持相同疗效以减缓毒副作用的发生以及减少或减缓耐药性的发生。当具有不同机制或作用模式的药物直接作用于单一靶点或某一种疾病时，可以起到更有效的治疗效果。阿卡波糖是一种典型的α-葡萄糖苷酶竞争性抑制剂，临床常用来治疗餐后高血糖。但大量或长期服用阿卡波糖可引起腹胀、腹泻等副作用。越来越多的证据表明，天然降糖产品与阿卡波糖联合使用可以提高阿卡波糖的疗效，延长其降糖活性。因此，针对糖尿病的治疗方案，迫切需要对传统药物和天然产物的联合使用进行研究。本实验通过将芦荟大黄素与阿卡波糖以不同质量浓度联合使用，结果表明芦荟大黄素与阿卡波糖具有协同抑制α-葡萄糖苷酶的作用，即芦荟大黄素与阿卡波糖联合使用能更好地改善降糖效果。目前，越来越多的研究表明两种不同类型的抑制剂同时使用时具有协同抑制α-葡萄糖苷酶的效果。Yang Jichen等曾报道过4 种黄酮类化合物（芹菜素、野黄芩素、高车前素和泽兰黄酮）与阿卡波糖联合抑制α-葡萄糖苷酶活性具有协同作用，其中，芹菜素与阿卡波糖组合的协同效果最好，低浓度和高浓度均有协同抑制作用，与本实验结果相似。本研究以芦荟大黄素作为蒽醌类化合物代表，采用抑制动力学、紫外光谱法、红外光谱法和荧光光谱法系统研究芦荟大黄素抑制α-葡萄糖苷酶的机理，并对芦荟大黄素和阿卡波糖联用的抑制作用进行了研究。芦荟大黄素IC50为75.97 μg/mL，阿卡波糖IC50为338.84 μg/mL，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖强。酶促反应动力学结果显示，芦荟大黄素以非竞争性和反竞争性混合型抑制类型方式与α-葡萄糖苷酶结合，且更倾向于与酶-底物的复合物结合。紫外光谱分析结果表明，芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶之间形成了一种新的复合物。FTIR分析结果进一步表明，芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶发生了相互作用并对其构象产生影响。芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的荧光光谱分析结果显示，芦荟大黄素通过静态猝灭的方式猝灭α-葡萄糖苷酶的内源性荧光，使其所处的环境发生变化，进而影响其活性。并且，芦荟大黄素与α-葡萄糖苷酶的结合主要以疏水相互作用为主。同时，芦荟大黄素与阿卡波糖联合使用抑制α-葡萄糖苷酶活性的结果显示，两者对α-葡萄糖苷酶的活性具有协同抑制作用。综上所述，芦荟大黄素能够很好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而有效地延缓了糖类的消化速度，这对于改善人体的血糖水平以及控制餐后高血糖都有非常重要的意义。因此，该研究可为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发利用提供一定的实验依据。本文《芦荟大黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制机理及其与阿卡波糖的协同作用》来源于《食品科学》2023年45卷第8期37-44页，作者：秦朝凤，李 姣，郝经文，卜雅琴，李 胜，陈乃东*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230530-281 。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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