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现代人的饮食和生活方式发生了巨大变化。糖和脂肪摄入过多，加上久坐不动的生活方式，高脂血症变得越来越常见。从食品中提取的这些生物活性物质已经被证实比药物更安全。鸡蛋蛋清具有高蛋白和易消化等特点，在开发生物活性肽方面具有巨大潜力，是食物衍生生物活性肽的极佳来源。蛋清摄入对血清总胆固醇（TC）水平和肝脏脂质代谢紊乱的影响已经得到广泛研究。目前，蛋清肽和水解物的研究主要集中在治疗氧化应激、免疫和降血糖等方面。但是关于蛋清源的生物活性肽/水解物在降血脂方面是否具有潜在功效，仍需要进一步深入地探索和验证。
华中农业大学食品科学技术学院的陈航、王玉林、黄茜*等人以蛋清为原料，采用肽酶433P制备蛋清水解物（EWH）。使用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠造高血脂模型，以辛伐他汀和市售VE水解物作为药物和食品阳性对照组。考察EWH对小鼠体质量、摄食量、血脂、肝脏脂质、肝脏损伤以及脂肪形态组织的影响，综合评价EWH的体内降血脂效果。并探究体外胃肠道消化对EWH的影响，对EWH和消化组分分别进行活性评价，并对体外模拟消化获得的消化产物SIF-2进行质谱鉴定和分子对接，从分子层面探究生物活性肽抑制胰脂肪酶的活性机理，以期为开发具有降血脂功能的EWH产品提供理论依据。EWH对喂养小鼠每日进食量的影响如图1A所示，在饲养的8 周内，不同实验组的单只小鼠日均进食量均约2～3 g。以此确定，在饲养的8 周时间内小鼠每日进食量对其体质量、脂质水平和肝脏损伤等指标变化基本无影响。
由图1B可以看出，在实验初期，各实验组小鼠体质量基本没有差别。8 周HFD后，高脂组小鼠的体质量与其余组小鼠相比显著增加。饲养期间，高脂组小鼠体质量上升迅速，而药物组、VE组与EWH组小鼠体质量上升较为缓慢。饲养结束后，通过比较饲养第8周与第0周小鼠的体质量之差（图1C），发现高脂组小鼠体质量增量极显著高于其余实验组（P＜0.01）。值得注意的是，EWH高低剂量组、VE高低剂量组与药物组之间的体质量增量并无显著性差异（P＞0.05）。实验结果表明，长期摄入EWH对小鼠体质量增长具有抑制效果，表明EWH具备较好的降低体质量、预防肥胖功效。高脂血症通常由HFD引起，是代谢相关疾病的严重危险因素。在此次实验中，选用C57BL/6小鼠作为高血脂模型动物。从图2可以发现，与空白组相比，经高脂饲养8 周后的小鼠血清TC和LDL-C水平发生极显著上升（P＜0.01），HDL-C水平发生极显著下降（P＜0.01），表明高脂血症小鼠出现血脂代谢紊乱，小鼠造模成功。经EWH灌胃治疗后，小鼠血脂代谢紊乱情况发生逆转。图2B中，EWH高剂量组的血清TC水平与空白组无显著性差异（P＞0.05）。但值得注意的是，EWH低剂量组的血清TC水平发生了一定程度的下降，但与高脂组和空白组均无显著性差异（P＞0.05）。图2C中EWH两个剂量组的血清HDL-C水平与空白组均无显著性差异（P＞0.05）。并且，灌胃VE水解物也同样降低了高脂小鼠血清TC水平、升高了HDL-C水平。图2D中，与高脂组相比，EWH组和VE组的血清LDL-C水平均发生极显著下降（P＜0.01），说明EWH和VE水解物具有较强的降低小鼠血清LDL-C水平的潜力。但是，并没有观察到高脂组小鼠血清TG水平发生明显变化（图2A），而这一现象此前也有文献报道，高脂饲养后空白组与高脂组之间的血清TG水平无显著性差异，发生这一现象的原因系C57BL/6小鼠品系对抗血清甘油三酯升高能力强。EWH灌胃组在一定程度上降低了血清TG水平，但与高脂组之间并无显著性差异（P＞0.05），说明血清TG水平并未受到EWH的显著性影响。但是VE组表现出与药物组类似的降低血清TG效果能力。综上所述，EWH在一定程度上显著降低了HFD诱导的C57BL/6小鼠血清TC水平和LDL-C水平，升高了HDL-C水平。说明对高血脂小鼠灌胃EWH能够在一定程度上调节HFD诱导的血脂异常，具有调节血脂代谢的潜在能力。![]()
高脂血症也是导致肝脂肪变性、肝损害等代谢性疾病的主要危险因素。如图3所示，高脂组小鼠肝脏脂质水平相较于空白组发生了极显著上升（P＜0.01），表明大量脂肪堆积在肝脏内部，高脂组小鼠发生了严重的脂质代谢紊乱。高脂饲养导致小鼠肝脏TG、TC水平升高至（3.05±0.10）、（3.85±0.11）mmol/L；VE高剂量组的TG、TC水平分别下降至（2.35±0.12）、（2.87±0.11）mmol/L，与高脂组相比，分别降低22.95%、25.45%；经EWH灌胃治疗后，EWH高剂量组的TG、TC水平分别下降至（2.16±0.10）、（2.73±0.14）mmol/L，与高脂组相比，分别降低29.18%、29.09%。灌胃EWH和VE水解物使小鼠肝脏TC、TG水平均发生了极显著下降（P＜0.01），二者降脂能力基本相当，且下降程度呈剂量依赖性。同样地，喂食中高剂量的核桃粕水解物也可降低高脂小鼠的肝脏TC、TG水平，但低剂量核桃粕水解物组并未表现出良好降肝脏脂质水平效果。综上所述，EWH逆转了HFD诱导的肝脏TC、TG积累，对脂肪肝的形成具有一定抑制效果，即使是低剂量组也表现出良好降脂效果。![]()
AST和ALT是肝脏中的主要代谢酶，其含量与肝功能受损相关，是肝脏炎症的重要指标。如图4所示，高脂饲养后高脂组小鼠AST和ALT水平分别是空白组小鼠的8.59 倍和7.76 倍（P＜0.01），表明HFD会使肝脏受损。经EWH灌胃治疗后，EWH组表现出与VE组类似的降低趋势：VE组的AST水平为高脂组小鼠的66.28%～86.14%，ALT水平为高脂组小鼠的64.38%～90.07%；EWH组的AST水平为高脂组小鼠的50.65%～82.27%、ALT水平为高脂组小鼠的65.48%～83.34%，均极显著低于高脂组的AST和ALT水平（P＜0.01）。De Campos Zani等发现，给HFD小鼠补充蛋清衍生肽不但改善了小鼠胰岛素敏感性，还减轻了小鼠肝脏脂肪变性及肝脏损伤。而本节实验结果发现，HFD会导致小鼠肝脏受损，而每日灌胃EWH能够显著改善由HFD引起的AST、ALT水平变化，表明EWH对高脂饲养引起的肝损伤具有肝脏保护作用。![]()
肝脏脂质沉积是脂肪肝的重要特征。采用苏木素-伊红（HE）染色评估EWH对HFD诱导的肥胖小鼠肝脂肪变性的影响。图5展示了不同组别小鼠肝脏组织HE染色切片的结果。空白组显示肝脏组织整体结构正常，肝细胞有序排列、结构松散。中央静脉清晰可见，肝窦围绕中央静脉呈放射状分布，肝窦巨噬细胞在其中可见（黄色箭头）。经过8 周HFD喂养后，高脂组的小鼠肝脏组织结构发生异常，肝细胞排列不规则，存在大量变性脂肪，形成较大的圆形脂肪空泡（黑色箭头）。VE组和EWH低剂量组肝脏组织整体结构异常程度中等，肝细胞排列不规则、着色均匀，存在少量变性脂肪。EWH高剂量组的肝脏组织整体结构轻度异常，肝细胞轻度脂肪变性，胞质内存在少量脂肪小空泡。通过比较高脂组、VE组和EWH组肝脏切片可以发现，灌胃VE水解物和EWH显著减缓了小鼠肝脏脂滴的数量及大小增长，其中EWH高剂量组的肝脏切片状态最接近空白组和药物组。本实验中，EWH减轻了由HFD引起的肝脏脂肪细胞的积累和变性，并改善了肝脏病理状态。![]()
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研究表明，成年小鼠脂肪细胞数量基本不会发生较大波动，所以当肥胖发生时，脂肪细胞直径会增大。如图6、7所示，与空白组相比，高脂组小鼠腹股沟脂肪细胞直径增大，该现象同时发生在小鼠附睾脂肪组织中，表明高脂饲养成功导致小鼠体内发生了脂肪堆积。而VE组和EWH组的平均脂肪细胞面积发生了显著的下降，表明灌胃VE水解物和EWH能够抑制脂肪的积累，改善高脂诱导的肥胖，这一结果与Ochiai等的研究结论一致。目前大量的研究表明，膳食水解物和肽可能的吸收端降血脂作用机制主要有以下几个主要方面：一是水解物和肽可以破坏肠道胆固醇胶束的溶解稳定性，减少膳食胆固醇的吸收；二是可以通过疏水作用或离子力结合胆汁酸，在肠道中形成不溶性复合物并随粪便排出；三是影响参与脂质代谢的胰脂肪酶活性，从而降低小肠对膳食脂肪的消化与吸收。因此，本节分别研究了EWH及其消化物对胆固醇胶束、胆汁酸以及胰脂肪酶的作用。
如图8A所示，EWH经胃肠道消化后抑制胆固醇溶解度能力下降。经胃部消化后，SGF-1（胃液消化1 h）与SGF-2（胃液消化2 h）降胆固醇活性仅存12%～16%，经胃肠共同消化后，SIF-1（胃液消化2 h后，肠液消化1 h）与SIF-2（胃液消化2 h后，肠液消化2 h）活性升至30%～50%；体外模拟消化对EWH胆汁酸结合能力的影响如图8B所示，发现经体外消化后EWH的胆汁酸结合能力基本保持不变，除了SGF-1组分（P＜0.05），EWH与其余3 组消化物胆汁酸结合能力并无显著性差异；体外模拟消化对EWH胰脂肪酶抑制能力的影响如图8C所示，经体外消化后EWH对胰脂肪酶仍具有较强抑制作用。值得注意的是，EWH首先经胃消化后，其胰脂肪酶抑制率显著下降（P＜0.05）。但是当继续进行肠消化后活性上升，其中EWH与SIF-1组分的胰脂肪酶抑制率并无显著性差异（P＞0.05），但SIF-1和SIF-2组分之间胰脂肪酶抑制率存在显著性差异（P＜0.05），可能是随着消化程度的加深，部分具有胰脂肪酶抑制作用的肽释放。综上所述，经体外胃肠道消化模型处理后，EWH的胆固醇胶束溶解度抑制能力下降，但胆汁酸结合能力以及胰脂肪酶抑制能力基本保持不变。对经过胃液肠液分别消化2 h后获得的SIF-2组分进行质谱鉴定，得到了1 444 个肽段，肽段分子质量分布在700～3 600 Da之间，主要集中在2 000 Da以下，该质谱鉴定仅能鉴定5 个氨基酸以上的肽段。有研究发现，寡肽具有高生物利用度、易吸收和高活性等特点。胰脂肪酶可将50%～70%的膳食脂肪水解为甘油单酯和游离脂肪酸，并被肠上皮细胞吸收，通过抑制胰脂肪酶活性可有效降低小肠对脂肪的吸收效率，达到降脂的目的。因此，在本研究中将鉴定出的多肽片段先筛选出氨基酸数量小于10的寡肽，然后将其通过AutoDock Vina软件进行分子对接，筛选出最具潜力的胰脂肪酶抑制肽。表3展示了分子对接能排名前10的肽段（由小到大）。
由表3可知，上述肽段与胰脂肪酶结合能均小于-7.3 kcal/mol，结合能越低，表明该肽段可能与胰脂肪酶结合越为紧密。其中，肽段LWVPSVY对接结合能最低，其次是YPILPEYLQ和WNIPIGTL，它们的结合能分别为-8.7、-7.9 kcal/mol和-7.8 kcal/mol。疏水性也是评价多肽生物活性的重要参数之一，有研究表明，疏水性对肽段的结构稳定性、与生物分子的相互作用以及在生物体内的分布和代谢等方面有重要影响，疏水性评分（GRAVY）＞0表明具有疏水性，反之，＜0则代表具有亲水性，肽段LWVPSVY具有最高疏水性评分（1.086），其次是肽段LPFASGTM（0.850）和WNIPIGTL（0.712）。之后，对结合能排名前3的肽段进行进一步分析，预测其与胰脂肪酶结合位点。
分子对接被用于揭示寡肽抑制胰脂肪酶的关键作用位点。图9显示了肽段LWVPSVY、YPILPEYLQ和WNIPIGTL与1ETH的最佳对接位置。
通过LigPlot+分子相互作用可视化图9A可以看出，LWVPSVY可以与1ETH残基（Leu189、Arg164、Ser323、Asp287、Pro285、Cys286、Phe326、Gln324、Glu383、Ala197、Asn320、Val322、Glu188、Asn167和Thr221）产生疏水相互作用，并与4 个不同的残基（Ser195、Val325、Pro194和Lys198）形成氢键。图9B中，1ETH的14 个氨基酸（Ser323、Val322、Pro194、Lys198、Ala197、Tyr327、Val325、Phe228、Ser219、Gln220、Gly168、Ser195、Pro194、Val322）与YPILPEYLQ形成疏水相互作用，与1ETH残基（Arg191、Thr221、Asp193、Glu188、His224和Asn167）之间共形成了6 个氢键。此外，由图9C可知，1ETH的16 个氨基酸（Asp12、Glu15、Lys248、Asn241、Ile242、Phe259、Asp258、Gln245、Val268、Cys262、Leu214、Asp206、Lys233、Cys238、Gln239、Gly237）与WNIPIGTL形成疏水相互作用，并与Asn213和Asn263形成氢键。对接结果表明，上述肽段与PPL至少两种相互作用，这些相互作用（氢键相互作用、疏水性相互作用、π-π相互作用/堆叠和范德华相互作用）可导致多肽与受体蛋白之间形成复合物或影响酶的构象，从而影响受体蛋白的正常生理功能，并表现出降血脂活性。在本研究中，通过动物实验灌胃EWH评价其体内降血脂活性能力。结果发现，EWH可以显著抑制小鼠的体质量增长，减少体质量增量。血清4 项指标测定结果显示，灌胃EWH可显著降低HFD诱导的鼠血清TC水平和LDL-C水平，并且升高HDL-C水平（P＜0.05）。肝脏炎症指标测定结果发现，EWH组AST和ALT水平极显著低于高脂组（P＜0.01）。HE染色结果表明，灌胃EWH可以改善肝脏组织和脂肪组织的脂肪积累。上述实验结果表明，长期摄入EWH能够有效抑制小鼠体质量增长、延缓肝脏及脂肪器官损伤、逆转血清和肝脏的脂质水平上升并且改善肝脏组织和脂肪组织（腹股沟脂肪与附睾脂肪）的脂肪积累。证明了EWH在体内具备较好的预防肥胖、降低血脂水平潜力。最后，对SIF-2组分进行了质谱鉴定及分子对接，鉴定得到了1 444 个肽段。分子对接结果显示肽段LWVPSVY、YPILPEYLQ和WNIPIGTL与1ETH具有强结合能力。通过PyMOL预测了肽段与胰脂肪酶结合位点，并采用LigPlot+分析分子之间的相互作用力，解析了肽段与酶紧密结合的原因是氢键的形成和氨基酸残基的疏水相互作用。本文《蛋清水解物降血脂功效的体内/体外评价及其活性肽的筛选与鉴定》来源于《食品科学》2024年45卷第21期10-19页，作者：陈航，王玉林，蔡朝霞，刘美玉，黄茜。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240418-173。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。
图片来源于文章原文及摄图网。
《食品科学》：江南大学翟齐啸教授等：肠道菌群研究模型和组学技术在食品化学危害物风险评估中的应用
