贵阳学院生物与环境工程学院、贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室叶婷副教授（第一作者）和李灿教授（通信作者）通过酶解和超滤技术，从大鲵（Andrias davidianus）皮肤中提取不同分子质量胶原蛋白肽，并对其抗肿瘤活性进行分析。优化提取工艺，筛选出具有最佳抗肿瘤活性的胶原蛋白肽。本研究将有望为未来大鲵资源的深加工和抗肿瘤活性胶原蛋白肽的制备提供科学理论依据，同时也为大鲵皮肤这一珍贵资源的综合利用提供新的思路和机遇。两栖动物皮肤及其分泌物作为外源性的生物活性肽来源，引发了对其生物学和医学潜力的广泛研究兴趣。然而，尤其是在可食用的两栖动物如青蛙和大鲵的皮肤中，这些潜在的生物资源一直被浪费，没有得到充分的利用。这些废弃物中所含的生物活性肽却具有巨大的潜力。各种生物活性肽已经从这些来源提取并被报道，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等多种生物活性。大鲵，又被称为中国大鲵或川鲵，是一种珍稀的两栖动物，被认为是世界上最大的两栖动物之一。近年来，大鲵因其独特的生物学特性引起了广泛的关注，尤其是其皮肤组织中所富含的胶原蛋白。胶原蛋白是一种关键的结构蛋白质，广泛分布于动物的皮肤、骨骼、肌肉和结缔组织中，具有多种生物活性。在养殖繁育的大鲵皮肤中，胶原蛋白丰富，含量为（19.00±2.66） g/100 g（湿质量），占皮肤总蛋白质的62.89%。大鲵皮胶原蛋白的酶解提取率达到44.43%，氨基酸组成分析结果显示，大鲵皮胶原蛋白中甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的含量较高，因此，营养价值高。大鲵皮肤黏液蛋白提取物被发现具有抗肺癌活性，可用于肺癌治疗。此外，从大鲵皮肤中提取的多肽具有抗氧化和抗菌活性，为天然保健品和抗菌剂的开发提供了潜在机会。据研究报道胶原蛋白肽的活性与其分子质量存在一定的相关关系，因此关于大鲵皮肤胶原蛋白肽的活性与其分子质量关系的研究需引起关注。然而，关于大鲵皮胶原蛋白的分析主要局限于抗氧化活性的分析，对于大鲵皮肤中不同分子质量抗肿瘤活性肽的提取、制备和活性分析研究相对较少。图1揭示了大鲵皮肤胶原肽（giant salamander skin collagen peptides，GSKCP）的最佳生物活性和剂量和分子质量响应特性。其中，300～1000 Da的组分对A549细胞表现出最高的抑制活性。通过综合比较，发现利用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶（neutral protease，NP）在水解GSKCP时，对A549细胞的活力均有显著的抑制作用。值得注意的是，NP水解产物的整体抑制能力是最显著的。在0.2、0.6、1.0 mg/mL的NP-GSKCP质量浓度下，A549细胞的相对活性依次从（58.46±1.10）%降低到（40.90±1.57）%和（25.38±0.76）%。因此，鉴于NP-GSKCP，特别是NP-GSKCP-IV对A549细胞活性具有显著的抑制作用，故对其进行进一步的提取工艺优化和初步的体外抗肿瘤活性分析。研究结果进一步证实，胶原多肽的抗肿瘤活性与分子质量呈负相关。小分子活性肽通常位于蛋白质的相对分子质量和游离氨基酸之间，更容易被吸收和利用，胶原肽分子质量和抗肿瘤活性之间的负相关可能来自于生物利用度、细胞渗透和作用模式等因素的复杂相互作用。
如图2所示，优化后的NP-GSKCP-IV对A549细胞增殖表现出显著的抑制作用。在0.2、0.6、1.0 mg/mL的质量浓度下，A549细胞的活性分别降低至（56.86±2.20）%、（40.67±1.79）%和（29.46±0.59）%。图2 优化的NP-GSKCP-IV对A549细胞活力的影响NP-GSKCP-Ⅳ对A549细胞形态影响的结果如图3所示。在空白对照组中，A549细胞生长状态良好，牢固地黏附在底物上，细胞间紧密相连。形态上，它们呈现规则的长梭形。随着NP-GSKCP-Ⅳ质量浓度的增加，细胞数量显著减少，且细胞逐渐由长梭形转变为圆形，发生皱缩，排列变得松散，细胞间隙增大。![]()
图3 NP-GSKCP-Ⅳ对A549细胞形态的影响如图4所示，优化后的NP-GSKCP-IV显著抑制了A549细胞的迁移。在5.0 mg/mL的质量浓度下，经过48 h后，伤口愈合率降低至（36.55±2.22）%，表明细胞运动性受到了明显的抑制。图4 优化后的NP-GSKCP-Ⅳ对A549细胞侵袭能力的影响
如图5所示，优化后的NP-GSKCP-IV改变了A549细胞的周期分布，导致G0/G1期细胞比例增加，而S期细胞比例相应减少。具体而言，在5.0 mg/mL的质量浓度下，G0/G1期细胞比例从（30.28±2.55）%增加到（54.31±1.88）%，而S期细胞比例则从（36.14±0.30）%降低到（24.75±1.88）%。A.流式细胞术检测细胞周期；B.各细胞周期占比。与对照组相比，* P＜0.05，** P＜0.01。
图5 优化后的NP-GSKCP-Ⅳ对A549细胞周期的影响如图6所示，优化后的NP-GSKCP-IV有效地诱导了A549细胞的凋亡。与对照组（凋亡率为（4.63±0.64）%）相比，在0.2、0.6、1.0 mg/L的质量浓度下，凋亡率分别增加至（7.49±0.81）%、（15.98±1.35）%和（29.16±2.21）%。A.流式细胞术检测细胞周期；B.凋亡细胞占比。与对照组相比，* P＜0.05，** P＜0.01。
图6 优化后的NP-GSKCP-Ⅳ对A549细胞凋亡的影响通过单因素和响应面优化了小分子质量的NP-GSKCP-IV的提取工艺，确定了最佳工艺条件，提取率达到87.82%。分析NP-GSKCP-IV的氨基酸组成，发现其具有较高的必需氨基酸含量，表明具有较高的营养价值，具有功能性食品的开发潜力。此外，筛选的NP-GSKCP-IV具有较强的抗肿瘤活性，可通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长和迁移。The skin of the Chinese giant salamander (Andrias davidianus) is a rich source of collagen. However, current
research indicates limited efficiency and activity in collagen protease
hydrolysis from this source. Further enzymatic hydrolysis to produce small
molecular weight active peptides and their antitumor potential remain
underexplored. This study employed a two-step enzymatic hydrolysis method to
prepare small molecular weight collagen peptides (SMWCPs), followed by
ultrafiltration separation. The extraction process was optimized using
single-factor and response surface methodology. The amino acid composition of
SMWCPs was analyzed, and their antitumor activity was assessed in vitro through
cell migration, cell cycle, and apoptosis assays. Results revealed a negative
correlation between collagen peptide molecular weight and antitumor activity,
with optimal antitumor activity observed for peptides with a molecular weight
of 300–1 000 Da (neutral protease hydrolyzed Chinese giant salamander skin
collagen peptides (NP-GSKCP)). Optimal extraction conditions were: enzyme dosage
8 000 U/g, enzymatic hydrolysis temperature 52.6 °C, enzymatic hydrolysis pH
7.1, and enzymatic hydrolysis time 4.3 h, yielding 87.82% NP-GSKCP-IV. Notably,
NP-GSKCP-IV contained 55.31% hydrophobic amino acids. Treatment of A549 cells
with 5 mg/mL NP-GSKCP-IV significantly altered cell morphology, inhibited
migration, arrested the cell cycle at G0/G1 phase, and induced early apoptosis.
This study contributes to the development of efficient extraction techniques
for antitumor active ingredients from Chinese giant salamander skin and informs
the potential development of medicinal functional foods.![]()
李灿 教授
贵阳学院 校党委委员、副校长
李灿，男，理学博士，教授（二级教授），贵州大学博士生导师。现任贵阳学院校党委委员、副校长，贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室主任，贵州省山地生物资源保护与高效利用工程研究中心主任。教育部新世纪优秀人才、贵州省省管专家、贵州省“百”层次人才、贵州省优秀青年科奖、贵州省科技创新人才奖、贵州省青年创新人才奖、青年科技奖获得者。从事生物学、生态学教学科研工作，主要研究方向为储藏物昆虫学、特色生物资源功能物质开发与高效利用等。历年获批各级各类科研项目有国家自然科学基金项目3 项、国家博士后基金2 项、教育部人才项目1 项、国家星火计划项目1 项、省科技厅科技支撑计划项目、人才和创新平台项目等10 项、省教育厅学科、实验室、人才、团队和自然科学重点项目6 项等。出版专著情况：主编1 部，参编2 部。发表论文情况：共计发表论文60 篇，其中SCI论文50 篇。获贵州省科技进步二等奖4 项、三等奖1 项，贵阳市科技成果奖一等奖、二等奖1 项，中国产学研合作促进奖1 项，中国植物保护学位青年科技奖1 项。
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叶婷 副教授
贵阳学院生物与环境工程学院
叶婷，女，博士后，副教授，硕士生导师。现任贵阳学院生物与环境工程学院教师，贵阳贵安科技人才，贵州省科技厅专家库专家。主要研究方向食药资源开发利用。主持贵州省科技厅项目1 项，贵州省教育厅项目1 项，贵阳贵安科技人才培养项目1 项，以第一作者身份发表论文10余篇，获授权实用新型专利6 项。![]()
