林麝是珍贵的野生药用资源动物，已被列为国家一级重点保护野生动物。人工养麝是保护野生麝资源的有效途径，在林麝养殖群体中，高发病率和死亡率的化脓性疾病和肠炎性疾病一直是人工养殖规模扩大的重要制约因素。抗生素经常被用来治疗这类疾病。然而，抗生素的过度使用可能会导致动物肠道微生物组产生耐药性。因此，本研究通过从健康的林麝肠道中分离乳酸菌用于开发益生菌制剂，以期预防疾病和改善林麝健康状况。
陕西省微生物研究所的訾静、王琰、万一*等从健康林麝粪便中分离鉴定乳酸菌，以商品化副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）L22为阳性对照，测试分离株的耐酸和耐胆盐、抗菌活性、自聚集和疏水性、抗生素敏感性，进一步对筛选的分离株进行抗性基因分析和生长曲线测定。另外，本研究检测了分离株对一株化脓隐秘杆菌（Arcanobacterium pyogenes）LSN3（从林麝肠道化脓样本中分离，GenBank登录号OQ179914）的拮抗活性，以期筛选出具有良好抗菌活性的菌株，为开发适合林麝专用的益生菌制剂提供理论基础和可靠的菌株来源。
1 分离菌株的形态和鉴定结果
2 菌株耐酸和耐胆盐能力
12 株乳酸菌在不同pH值条件下的存活率结果见图2A。随着pH值的降低，菌株的存活率也随之降低。所有菌株均能在pH 4条件下生长，5 株植物乳植杆菌和1 株乳酸片球菌存活率达88.5%以上；在pH 3条件下，该6 株菌存活率达84%以上；在pH 2条件下，仅6 株菌存活率在33%～37%之间，其余均在30%以下。所有菌株在pH 4和pH 3（除SX100以外）条件下，存活率与对照菌相比无显著性差异，在pH 2条件下，有2 株菌（SX61和SX78）存活率与对照菌相比有显著性差异。
3 菌株上清液抑菌能力
12 株乳酸菌对常见病原菌的抑菌活性检测结果见表3。5 株植物乳植杆菌和乳酸片球菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肠炎沙门氏菌表现出较好的拮抗活性（抑菌圈直径17.20～20.19 mm），对化脓隐秘杆菌LSN 3 的抑菌活性（抑菌圈直径14.23～15.53 mm）优于对照菌株L22（抑菌圈直径10.05 mm）。其他6 株分离菌对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑菌圈直径为12.88～14.98 mm，对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌的抑菌圈直径为9.05～12.46 mm。
4 菌株自聚集能力和表面疏水性
5 菌株对抗生素耐药性
6 乳酸菌抗药性的基因型分析
根据特异性引物利用PCR技术对筛选获得的6 株乳酸菌的抗生素抗性基因进行分析，虽然所有菌株表现为环丙沙星和链霉素抗性，但这些菌株都不携带这两种抗生素的抗性基因。6 株乳酸菌中均检测出对万古霉素的抗药性基因vanX，琼脂糖凝胶电泳结果见图4。
7 菌株生长曲线
8 讨论
本研究从林麝粪便样品中筛选获得12 株乳酸菌，通过细胞个体形态特征和16S rDNA序列分析鉴定，包括4 个属、6 个种，其中植物乳植杆菌5 株，屎肠球菌3 株，乳酸片球菌、肠膜明串珠菌、耐久肠球菌和短乳杆菌各1 株，随后对分离株进行体外益生性能评价，包括耐受性、抗病原菌活性、抗生素敏感性和菌体表面特性（菌体自聚集能力和表面疏水性）。
潜在益生菌的重要标准之一是能适应胃肠道中的苛刻环境（胃酸的低pH值以及小肠胆盐形成的高渗透压环境），这迫使益生菌必须具有耐酸和耐胆盐能力才能在肠道中存活。许多研究认为pH 2～3是研究益生菌菌株耐酸性的最适pH值。本研究采用pH 2、3和4考察菌株的耐酸能力，采用胆盐质量分数0.5%和1.0%作为考察菌株耐胆盐的指标。结果表明，所有乳酸菌对低pH值（pH 3和pH 4）和胆盐（0.5%和1.0%）均具有良好的耐受性，表现出不同的存活率，说明乳酸菌的耐受能力具有菌株特异性。植物乳植杆菌和乳酸片球菌在pH 3的环境中，存活率分别最高达90.5%和89.5%。在质量分数1.0%胆盐环境中，存活率分别最高达89.5%和73.5%，高于之前报道的乳酸菌在相同条件下的存活率。所有分离株在pH 2的环境下存活率大幅下降，这与前人报道的“许多益生菌在pH 2或更低的条件下，菌株的存活率显著下降”这一结果相似。
体外对致病菌的抗菌活性被认为是益生菌的重要益生特性。本研究评价12 株乳酸菌对常见肠道病原菌的抑菌活性。植物乳植杆菌和乳酸片球菌上清液对5 种病原菌均表现出抗菌作用，其中对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌性（抑菌圈直径＞16 mm）优于先前的报道。短乳杆菌、肠球菌和肠膜明串珠菌对病原菌的抗菌活性较弱，或者无抑菌活性。所有的菌株上清液被中和后（pH 6），抗菌活性大幅降低（数据没有列出），说明分离株的抑制特性主要归因于有机酸的产生。本研究首次报道了植物乳植杆菌和乳酸片球菌对林麝源化脓隐秘杆菌具有一定程度的抑制作用，抑制效果优于其他菌株，这可能与其发酵pH值有关。植物乳植杆菌和乳酸片球菌在培养24 h后pH值在3.8～3.9，其他几株分离株pH值在4.0～4.5。
细菌的黏附能力被认为是益生菌选择的重要标准。尽管在本研究中没有直接探究乳酸菌对上皮细胞的黏附能力，但通过自聚集能力和疏水特性来间接评估其黏附能力。益生菌的自聚集能力影响其对肠上皮细胞的黏附。本研究测定植物乳植杆菌、肠球菌和乳酸片球菌在6 h后，自聚集率达到了50.9%～56.8%，与之前报道的结果相似。疏水性使得益生菌与宿主上皮细胞之间的相互作用增。本研究通过探究与氯仿的相互作用模拟黏附于肠上皮细胞的能力。参照Lu Youyou等报道对疏水性程度的划分标准，12 株分离菌中有7 株表面疏水率在52.4%～56.0%之间，表明它们可能具有较高的黏附性，这是菌株能够发挥其潜在功能的重要前提。其中植物乳植杆菌的疏水率最高达56%，其次为屎肠球菌（53.5%）和乳酸片球菌（52.9%），这与之前文献报道乳酸菌的疏水率在60%结果相似。结合自聚集能力评估结果，推断植物乳植杆菌、屎肠球菌和乳酸片球菌可能具有较高的黏附活性，易黏附于肠道细胞发挥益生作用。
益生菌的一个重要安全要求就是不可携带可转移抗性基因，因此益生菌的候选菌株必须鉴定其抗生素敏感性，并有必要进行抗性基因的测定和可转移性分析。本研究评价了12 株乳酸菌对9 种抗生素的耐药性。大部分菌株表现出对链霉素、环丙沙星和万古霉素高耐药性。4 株肠球菌对6 种抗生素的敏感性存在较大差异，说明肠球菌对抗菌药物的敏感性具有种属依赖性。先前研究表明，屎肠球菌对万古霉素具有高耐药性，但本研究测试的3 株屎肠球菌对万古霉素呈现中度耐药。结合体外益生菌评价实验的结果，本研究筛选出具有良好益生潜力的5 株植物乳植杆菌和1 株乳酸片球菌作为益生菌候选菌株，进一步对这6 株乳酸菌进行抗药性基因分析。结果发现，抗性表型与基因型差异很大，尽管菌株表现出对环丙沙星和链霉素的抗性，但是没有扩增到环丙沙星和链霉素的抗性基因，说明这些乳酸菌表现出的抗性属于固有抗性，其抗性产生可能与细胞膜对该抗生素的低渗透性有关，一般这类抗性是安全的，不发生基因转移。此外，筛选出的6 株乳酸菌均检测出万古霉素抗性基因vanX，这与之前报道的vanX基因广泛存在于乳酸菌中结论一致。
9 结论
本文《林麝肠道中乳酸菌的分离筛选及益生特性》来源于《食品科学》2024年45卷8期79-86页。作者：訾静，王琰，李亮亮，张琨，万一。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230818-134。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
近期研究热点
《食品科学》：江南大学翟齐啸教授等：肠道菌群研究模型和组学技术在食品化学危害物风险评估中的应用
