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卵清蛋白（OVA）是主要的致敏蛋白，可诱导辅助性T-2（Th2）过敏反应，目前的治疗方案尚不充分。在这项研究中，通过漆酶/咖啡酸（Lac/CA）催化与半乳甘露聚糖（Man）的交联，开发了一种低过敏性的聚合OVA产品。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting分析高分子量交联聚合物的形成和IgG的结合。研究表明，Lac/CA催化的交联＋Man偶联极大地改变了OVA的二级和三级结构，并改变了OVA的表面疏水性。胃肠消化稳定性试验表明，交联OVA在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中表现出较小的抗性。小鼠模型研究表明，Lac-Man/OVA改善了嗜酸性气道炎症反应，有效下调Th-2相关细胞因子（白细胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13）的表达，上调IFN-γ和IL-10的表达。用Lac-Man/OVA刺激骨髓源性树突状细胞可抑制表型成熟标志物（CD80和CD86）和MHC II类分子的表达，抑制炎性因子的表达水平。本研究获得的知识为获得低过敏性OVA产品提供了有效途径，该产品可以缓解OVA诱导的过敏性哮喘的治疗效果。
天然OVA和交联OVA的电泳图谱如图1A所示。结果表明，单独或与Man联合使用Lac/CA-酸交联的OVA降低了天然OVA的密度（45 kDa）（图1A）。然而，单独用Man（Man-OVA）处理OVA并没有显示出任何明显的效果（图1A，Lane 2）。当用Lac/CA（Lac-OVA）处理OVA时，在100 kDa左右和180 kDa以上观察到具有优势MW的新波段（图1A，Lane 3），表明产生了高MW交联。LacOVA与Man偶联（Lac-Man/OVA）形成高分子量交联（＞180 kDa），天然OVA带强度大幅降低（图1A，Lane 4）。Western blot分析表明，交联后，45 kDa处OVA的IgG免疫反应带密度降低。此外，在Lac-Man/OVA的情况下，高分子量聚集体对IgG抗体表现出反应性（图1B，Lane 3）。而在Lac-Man/OVA的情况下，高分子量聚集体不被IgG结合识别（图1B，Lane 4），这表明结合表位发生了变化。
在紫外吸收光谱和荧光光谱的基础上评估了蛋白质三级结构的变化。紫外吸收光谱显示，Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA的波长分别从277 nm（OVA）增加到273、272和276 nm（蓝移）。而与天然OVA相比，Lac-OVA和Lac-Man/OVA的最大吸光度峰增加了~1.7倍和~5倍（图1C）。与天然OVA相比，Lac-Man/OVA的荧光强度降低幅度最大（约45倍），而Man-OVA（约2.5倍）和Lac-OVA（约8.5倍）的荧光强度也有所下降（图1D）。波长从332 nm（OVA）到335 nm（Man-OVA）和336 nm（Lac-OVA和Lac-Man/OVA）红移。表面疏水性分析表明，Lac-Man/OVA的峰值荧光强度并没有明显增加，而Man-OVA和Lac-OVA的表面疏水性分别增加了约3.5倍和1.7倍（图1E）。
CD光谱分析表明，OVA的聚合导致了更复杂的结构，α-螺旋和β-折叠的强度发生了变化（图1F）。正的摩尔残留椭圆度峰表示存在β-折叠结构，而两个负峰表示存在α-螺旋结构。与其他处理的OVA相比，Lac-Man/OVA显示出最大的阳性峰和阴性峰减少，表明OVA构型的二级结构发生了实质性的改变。此外，Lac介导的交联以及Man偶联引起了粒径和zeta电位的变化。OVA、Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA的平均粒径分别为115、170、233.1和382.2 nm（图1G），其中Lac-Man/OVA的粒径分布增幅最大。用Lac/CA处理后zeta电位结果显示为负趋势，而与Man偶联导致zeta电位值中性（图1H）。这些结果表明，Lac/CA催化交联与Man偶联制备了高分子量聚合物，改变了OVA的构象结构。
在本研究中，进行了胃肠消化稳定性实验，观察Man和Lac/CA处理的OVA蛋白组分的变化（图2）。根据SDS-PAGE结果，天然OVA的原始条带在1小时内被胃蛋白酶轻微消化（图2A），而Man-OVA在5 min后开始消化，45 kDa处的条带在消化1 h变得非常弱（图2B）。Lac-OVA在45 kDa处的原始OVA带在消化2 min后完全消失，高分子量聚合物对胃消化表现出抗性（图2C）。Lac-Man/OVA对SGF的稳定性较弱，高分子量聚合物在15 min后完全降解（图2D）。
同样，在SIF消化期间，天然OVA对胰蛋白酶消化表现出很高的稳定性（图2E）。SIF结果表明，Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA表现出不同的消化模式，与消化性消化相比，稳定性较弱（图2F-H）。SIF消化2 min后，原OVA条带几乎消失，形成15～20 kDa左右的消化片段，消化1 h后密度减小。此外，Lac-Man/OVA的大分子带在2 min后完全消失（图2H），而Lac-OVA的高MW带直到30 min才被消化（图2G）。这些结果表明，随着消化期的延长，降解程度越来越明显。消化酶和胰蛋白酶消化的结果表明，Lac/CA催化的交联加Man偶联显著提高了OVA的消化率。
本研究建立了过敏性哮喘模型，以评估Lac/CA辅助交联结合Man对OVA诱导的过敏性炎症的潜在治疗和预防作用。与OVA组相比，相同剂量的Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA治疗显著降低了BALF（图3A）和肺（图3B）中的浸润细胞总数。为了了解交联OVA抑制气道炎症的机制，通过qPCR和流式细胞术检测了肺组织中细胞因子的表达。qPCR结果显示，Lac-Man/OVA显著增强了肺组织中Ifng和Il10的表达，但显著抑制了Th-2型细胞因子（Il4、Il5和Il13）的表达（图3C）。细胞内染色显示，与天然OVA组相比，交联OVA（Lac-OVA和Lac-Man/OVA）处理的小鼠肺组织中IL-4+、IL-5+和IL-13+ CD4+ T细胞的百分比较低（图3D-F），而两组中IFN-γ+ CD4+ T细胞的百分比显著较高（图3G）。综上所述，这些结果表明Lac/CA交联的OVA与Man结合通过调节Th1/Th2平衡来抑制Th2反应。
交联OVA可减轻Th-2诱导哮喘模型的哮喘发展
交联OVA调节脂多糖诱导的BMDCs成熟和抑制促炎细胞因子的产生
Laccase/caffeic acid-catalyzed crosslinking coupled with galactomannan alters the conformational structure of ovalbumin and alleviates Th2-mediated allergic asthma
Ishfaq Ahmeda,b, Suidong Ouyanga, Shengquan Wua,c, Haochang Songa,c, Miaoyuan Zhanga,c, Renxing Luoa,c, Peishan Lua,c, Jiaqi Denga,c, Tingting Zhenga, Yanyan Wanga, Xinguang Liua, Gonghua Huanga,*
a Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, The First Dongguan Affiliated Hospital, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China
b Haide College, Ocean University of China, Laoshan Campus, Qingdao 266100, China
c School of Medical Technology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China
*Corresponding author.
Abstract
Ovalbumin (OVA) is the major allergenic protein that can induce T helper 2 (Th2)-allergic reactions, for which current treatment options are inadequate. In this study, we developed a polymerized hypoallergenic OVA product via laccase/caffeic acid (Lac/CA)-catalyzed crosslinking in conjunction with galactomannan (Man). The formation of high molecular weight crosslinked polymers and the IgG-binding were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. The study indicated that Lac/CA-catalyzed crosslinking plus Man conjugation substantially altered secondary and tertiary structures of OVA along with the variation in surface hydrophobicity. Gastrointestinal digestion stability assay indicated that crosslinked OVA exhibited less resistance in simulated gastric fl uid (SGF) and simulated intestinal fluid (SIF). Mouse model study indicated that Lac-Man/OVA ameliorated eosinophilic airway inflammatory response and efficiently downregulated the expression of Th2-related cytokines (interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-13), and upregulated IFN-γ and IL-10 expression. Stimulation of bone marrow-derived dendritic cells with Lac-Man/OVA suppressed the expression of phenotypic maturation markers (CD80 and CD86) and MHC class Ⅱ molecules, and suppressed the expression levels of proinfl ammatory cytokines. The knowledge obtained in the present study offers an effective way to acquire a hypoallergenic OVA product that can have a therapeutic effect in alleviating OVA-induced allergic asthma.
AHMED I, OUYANG S D, WU S Q, et al. Laccase/caffeic acid-catalyzed crosslinking coupled with galactomannan alters the conformational structure of ovalbumin and alleviates Th2-mediated allergic asthma[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 1962-1973. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250163.
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