HLA基因位于第6号染色体短臂(6p23.1)上,由一群紧密连锁的复等位基因位点组成,是目前所知与免疫反应相关的最复杂的遗传多态系统。全基因组筛查研究认为HLA-DRB1*03、DRB1*04与1型糖尿病 呈高度正相关性,而HLA-DR2(HLA-DRB1*15、HLA-DRB1*16)为其负相关(保护)基因[1]。日本报道DRB1*0901-DQB1*0303在1型糖尿病增多,HLA-DRB1*0405与妊娠相关的爆发型1型糖尿病(fulminant type1 diabetes)有关[2]。近年来,香港学者提出在香港中国人群中以HLA-DR3、DR4作为1型糖尿病和2型糖尿病进行区别的遗传标志物[3]。根据上述研究,毗邻香港的广东省汉族GDM的产妇中可能存在迟发型1型糖尿病病因,当她们妊娠时可能由于胎盘胰岛素酶增加胰岛素降解,胎盘催乳素和雌激素拮抗胰岛素的作用,使其出现血糖升高,进而出现症状,危及母婴安全。因此,我们对广东妊娠期糖尿病孕妇抽样进行HLA-DRB1分型,探讨广东省产妇发生GDM的遗传背景。1. 研究对象:2004年1月至12月来院产前检查的孕前无糖尿病史广东省籍汉族孕妇,常规于孕24~28周期间进行50g糖筛查,筛查异常的孕妇进一步行75g口服糖耐量试验(OGTT)(禁食12h后,口服葡萄糖75g。测空腹和服糖后1h、2h、3h四个时点血糖,正常值为5.6、10.3、8.6、6.7mmol/L)。(1)研究对象:分组标准:①正常组:50g糖筛查值<7.2mmol/L的孕妇;②可疑正常组:50g糖筛查值7.2~7.8mol/L或升高(筛查值>7.8mmol/L),但OGTT检测正常;③IGT 组:75gOGTT 结果仅一次异常的孕妇;④GDM组:75gOGTT 结果两次异常或两次空腹血糖≥5.6mmol/L或任何一次血糖≥11.1 mmol/L,且再测空腹血糖≥5.6mmol/L的孕妇。IGT和GDM的诊断标准均依据乐杰主编的《妇产科学》第6版。(2)排除标准:除外高血压、风性疾病、哮喘以及其他HLA相关性疾病,无输血、器官移植、免疫治疗史的孕妇。(3)分组:正常组73例;可疑正常组37例;GDM组116例;IGT组60例。2. 实验方法:采孕妇静脉血2ml,EDTA 抗凝,将孕妇的血细胞用快速盐析法提取基因组 DNA,并将其 DNA 溶于TE液中,-20℃冰箱内保存备检。采用序列特异性引物聚合酶链反应杂交技术进行HLA-DRB1基因分型。根据HLA-DRB1第二外显子内3个超变区顺序特异序列合成引物(参照美国国家组织相容实验室标准序列,分别为5′CGTGTCCCCACAGCACGTT-3′和5′-CCGCTGCACTGTGAAGCT-3′,委托上海博亚生物公司合成),按扩增反应条件为94℃变性40s,54℃退火45s,72℃延伸40s,循环30个周期,72℃延伸5 min。用地高辛标记探针(HLA-DR探针35条,探针序列按照美国国家组织相容实验室标准序列、由上海博亚生物公司合成),将PCR产物固定在杂交尼龙膜上,然后与带有地高辛标记的探针杂交,洗膜后通过化学荧光检测并记录到 X线胶片上,再进行结果判读[4]。3.统计学方法:数据采用 SPSS12.0统计软件处理,各组间等位基因频率分布差异采用χ2 检验及精确概率法。采用直接计数法统计阳性基因数,等位基因频率(%)为阳性基因数/(样本数×2)。1.GDM组与正常孕妇组 HLA-DRB1基因分布情况:与广州市脐血库1547例脐血样本进行χ2检验,正常组数据差异无统计学意义(χ2=13.68,P>0.05),样本具有代表性。GDM与脐血库样本比较差异有统计学意义(χ2=27.98,P<0.01)。各组HLA-DRB1等位基因频率分布情况见表1。2.各组等位基因分布频率:比较糖尿病相关HLA-DRB*03,DRB1*04,DRB1*09各等位基因分布情况,50g糖筛查值正常组与可疑 正常组之间差异无统计学意义(χ2=7.023,P>0.05);可疑正常组与IGT、GDM 三组间比较,三组间上述相关等位基因分布频率差异无统 计学意义(χ2=6.322,P>0.05);正常组与IGT、GDM组三组间比较,上述相关等位基因分布频率差异有统计学意义(χ2=17.469,P<0.05)。其中正常组与IGT比较(χ2=10.19,P<0.05);正常组与GDM比较(χ2 =12.573,P<0.05);HLA-DRB1*04基因频率,IGT和GDM组孕妇都比正常组的孕妇升高(分别为χ2=5.638,P<0.05;χ2=9.745,P<0.01)。GDM组和IGT组比较上述相关等位基因分布频率差异无统计学意义(χ2=5.449,P>0.05)。![]()
与正常孕妇比较,GDM 妇女的 HLA-Ⅱ类的等位基因频率分布是否存在差异的问题存在争议。意大利、沙特阿拉伯和瑞典有研究认为,与非糖尿病的妇女比较,GDM、IGT妇女样本的HLA-Ⅱ类的等位基因频率分布差异无统计学意义[5-7]。但中国天津宋殿荣等[8]报道,30例GDM组HLA-DR6(13)基因频率(12%)明显高于对照组。当孕妇为HLA-DR3基因型或 HLA-DR6(13)/DR9基因杂合型时,其GDM 病情较重且产后血糖多未恢复正常。
本研究分析广东汉族GDM 和IGT孕妇组间 HLADRB1等位基因分布频率,发现各等位基因分布频率间差异无统计学意义,但在GDM和IGT组的HLA-DRB1*04基因频率,比50g糖筛查值正常组升高,由于糖尿病可能在高血糖被发现之前已经存在相当长的一段时间,GDM 中很可能存在1型糖尿病亚临床期的患者,存在遗传异质性。各研究群体的种族、地理位置和生活饮食习惯不同,不同的族群中,自身免疫在发病过程中所起的作用大小可能也不同,这可能是本研究与其他研究发现HLA-DRB1的等位基因频率分布不同的原因。
此外,由于正常人分组不同也可能是本研究与其他研究发现HLA-DRB1的等位基因频率分布不同的原因。刘向蕊等[9]对50g糖筛查异常≥7.2mmol/L而葡萄糖耐量试验正常的孕妇平均7周后重复进行葡萄糖耐量试验,发现27.3%的孕妇发展为妊娠期糖尿病,27.3%发展为妊娠期糖耐量受损。糖筛查异常而糖耐量试验正常也是发展成GDM或妊娠期糖耐量受损的高危因素。以往研究的正常组包含可疑正常人群,如将本研究正常组与可疑正常组合并,合并组与IGT、GDM组比较则发现三组间HLA-DRB1的等位基因频率分布差异无显著性统计学意义。本研究将正常人群进一步分组,发现50g糖筛查值可疑或升高,但OGTT检测正常的正常孕妇组,与IGT、GDM和50g糖筛查值正常组比较HLA-DRB1等位基因频率比较差异均无统计学意义,说明这一人群处于疾病与正常人群的交界,一旦出现感染、应激等不利因素或随孕期进展,可能会向IGT或GDM发展,孕期应注意监测。
糖尿病是多基因疾病,多种免疫、遗传因素影响其起病、病程和转归,本研究结果提示50g糖筛查值可疑或升高,但OGTT检测正常的正常孕妇与IGT和GDM患者可能有相同的1型糖尿病遗传负荷,孕期需注意观测、复查。HLADRB1*04在广东地区可能与妊娠期糖尿病患病易感性增加相关,这些孕妇中可能包含亚临床期的1型糖尿病患者诱发疾病发生和进展的其他因素有待日后进一步探讨。
志谢:感谢美国国家组织相容实验室余进老师予以技术指导。
