撰文：Vergil
编辑：RNAScript
排版：三姐夫
脂质纳米颗粒（LNP）包封mRNA的过程是一个随机性的纳米囊泡融合过程，在同一批次中，一个LNP可以包含0或多个不等的mRNA拷贝数。由于亲水性聚乙二醇（PEG）脂质驱动了中性态可电离脂质的融合终止，LNP的最终大小在很大程度上取决于PEG脂质的表面浓度。约翰霍普金斯大学毛海泉/王泽辉研究团队通过其研发的集成式光谱-色谱分析方法发现，LNP的粒径均一性并不总是意味着mRNA的有效载荷量和脂质组分的均一性。因此，LNP的最终尺寸并不一定准确反映其包封的mRNA拷贝数。
多项研究已初步探究了“泡”结构以及空载LNP对LNP异质性和作用效力的影响，但未深入探讨mRNA负载水平对LNP功能性递送的影响。尽管从QC的角度来看，这些特殊结构和异质性特征已成为LNP制剂普遍的组成部分，考虑这些特殊结构的存在是合理和相对安全的，但对于研究和研发而言，mRNA-LNP制剂因mRNA载荷量不同导致的额外复杂性和异质性应该得到更详细的研究。
2024年12月31日，不列颠哥伦比亚大学Pieter Cullis团队联合Anna Blakney团队在ACS Applied Materials & Interfaces上发表了题为“Transfection Potency of Lipid Nanoparticles Containing mRNA Depends on Relative Loading Levels”的研究论文。由于mRNA-LNP制剂的质量密度取决于mRNA上样水平，研究团队基于不同mRNA负载水平LNP与水环境之间的密度差异，采用分析超速离心（AUC）技术分离了不同mRNA负载水平的LNP，并进一步表征了不同负载水平对LNP理化性质和体内外功能性递送的影响。
LNP-mRNA的分级离心分离
LNP在离心场中的终端速度（大小和方向）在很大程度上取决于它们的质量密度，对于两个不同质量密度的LNP而言，当一个比溶剂重而另一个比溶剂轻时，它们的移动方向就会在离心时发散。
研究者首先采用“T字形”微流控混合，以6的N/P比快速混合萤火虫荧光素酶mRNA（mFluc）和KC2/DSPC/胆固醇/PEG-DMG（50/10/38.5/1.5 mol%）脂质混合物，在PBS缓冲液中透析过夜，以产生最终的LNP。300,000 RCF超速离心后分别收集上三分之一作为低密度LNP（LDLNP），下三分之二LNP作为高密度LNP（HDLNP），原始批次称为OLNP。使用DiD染色以便目视检查（图1）。
图1. 超速离心后DiD染色LNP的目视检查
动态光散射（DLS）分析显示，超速离心前后LNP维持结构完整性（图2B）；RiboGreen测定显示没有mRNA被释放，包封效率均超过98%；毛细管电泳未发现mRNA降解迹象（图2C）。OLNP、LDLNP和HDLNP包封mRNAs的整合百分比分别为91.7%、94.4%和91.0%。
图2. 根据LNP的mRNA负载水平进行分级离心分离
不同mRNA负载对LNP的影响
脂质组成和N/P比
由于mRNA与脂质间的自组装依赖于静电相互作用，研究人员首先探索了mRNA负载变化是否导致脂质组成的显著变化。使用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）表征OLNP、LDLNP和HDLNP的脂质组成，未观察到显著差异。此外，配制过程中采用不同的N/P比不会改变最终脂质的组成，计算出OLNP、LDLNP和HDLNP的实际N/P比分别为2.9、7.5和0.5。
图3. 脂质组成和N/P比表征
LNP形态
接下来，研究人员使用冷冻电镜检查并分析了LNP亚群的图像，以研究LNP形态（大小和各向异性）如何取决于mRNA负载水平（图4A）。
图4. mRNA负载水平影响LNP形态
制备的OLNP由没有泡结构的球形LNP和泡结构非球形LNP组成（图4A1）；LDLNPs的mRNA负载量相对较低，大多数（约70%）LNP没有气泡，少部分表现出单个小泡（图4A2）；HDLNP在具有泡结构时，通常会更大，并且偶尔会有多个泡呈现在同一颗粒上（图4A3）。如图4C,D所示，对LNP形态的各项数据进行了测量并绘制散点分布图，以表现LNP的大小分布。
研究者发现，带有泡结构的颗粒百分比与mRNA负载水平之间具有相关性，LDLNP具有相对更低比例的泡结构LNP。对于泡结构LNP，其大小和各向同性取决于mRNA负载水平，而无泡LNP具有相似的大小和各向同性。有趣的是，mRNA负载水平也会影响泡结构的尺寸大小，负载水平越高越容易形成更大的泡结构。
这些结果表明，mRNA负载水平可以影响泡结构LNP的形态，但不会影响无泡结构LNP的形态。对于带泡结构的LNP而言，更高的负载水平会导致LNP更大尺寸、更高的各向异性、更大的泡结构和/或更多泡结构。
表1. 基于CryoEM图像的LNP形态定量
体外递送
将载有Cy5-mEGFP的OLNP/LDLNP/HDLNP与HEK293细胞共孵育，并用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查Cy5和EGFP信号。研究表明，虽然三种LNP的mRNA细胞摄取水平相当，但mEGFP的表达水平各不相同，OLNP和LDLNP表达量明显高于HDLNP。
此外，通过DiD标记LNP，Rab7a标记晚期内体研究三种LNP的内体逃逸差异，HDLNP的共定位程度更高，Pearson系数为0.75，逃逸水平显著低于OLNP和LDLNP。
图5. 体外转染细胞摄取和功能递送差异
体内递送
在体外实验基础上，研究者进一步在小鼠体内探索了不同负载LNP的翻译效率和生物分布。与体外实验相似，HDLNPs制剂在体内mRNA功能性递送中效果最差，比OLNP/LDLNP低20倍，但仍比对照组高1000倍，LDLNP产生的发光强度比OLNP高50%（图6B）。三种LNP的肝脏和脾脏发光保持相同的趋势（图6C）。
图6. 体内功能递送对比
总结
本研究初步揭示了不同负载水平对LNP理化性质和体内外功能性递送的影响。研究表明，mRNA负载水平相对较低的LNP显示更小和更少的泡结构，而具有高mRNA负载的LNP表现出更大和更多的泡结构。mRNA负载水平主要改变LNP的转染效力，但不改变有效载荷的生物分布。高负载水平可能导致制剂偏离最佳N/P比，从而降低了LNP的转染效力。
Anna Blakney博士作为RNA World科学顾问委员会成员，将参与今年9月在上海举办的第二届RNA World 2025论坛
参考资料
Liao S, et al., Transfection Potency of Lipid Nanoparticles Containing mRNA Depends on Relative Loading Levels. ACS Appl Mater Interfaces. 2024 Dec 31. doi: 10.1021/acsami.4c20077.
