英文原题：Unusual Hydrophobic Property of a Blue Fluorescent Amino Acid: 4-Cynaotryptophan
通讯作者：盖锋，北京大学
作者：Manxi Wang（王曼茜），Bo Zhuang（庄勃），Kailin Tang（汤凯麟），Ran-ran Feng（冯冉冉）
背景介绍
蛋白质通过折叠成不同的三维结构和构象执行其生物功能，疏水作用是驱动蛋白质折叠的关键因素之一。热力学上，蛋白质的结构/构象或者疏水环境的变化会引起体系吉布斯自由能的变化，即引起焓值、熵值和比热容等热力学量的变化。例如，蛋白质构象的变化常伴随着比热容的变化。学界普遍认为，与蛋白质折叠前相比，折叠后的蛋白质与溶剂接触的疏水表面积减少，导致体系恒压比热容减少（ΔCp为负值），因此自由能变化（ΔG）对温度的依赖呈现出非单调性。这说明蛋白质在某一特定的温度稳定性最强，而升高或降低温度都会导致其稳定性降低（即蛋白质解折叠）。尽管学界认为蛋白构象变化以及蛋白质与水的相互作用（疏水/水合作用）共同影响了蛋白质比热容Cp（或 ΔCp），目前仍然较难通过实验的方法区分这两种影响的贡献。
文章亮点
北京大学盖锋教授课题组构建了一个由两个甘氨酸和两个4-氰基色氨酸残基组成的四肽分子（GWCNWCNG，G为甘氨酸，WCN为4-氰基色氨酸）作为微蛋白质模型系统，并应用时间分辨荧光光谱、分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）计算研究了该四肽分子在水溶液中的构象转变以及转变过程中体系的热力学性质，实验上明确区分了水合作用对体系比热容变化的影响。四肽设计中使用了荧光特性优异的非天然氨基酸4-氰基色氨酸（4CN-Trp，蓝色荧光团）。4CN-Trp的荧光衰减动力学性质能够定量地与四肽的构象转变相联系（图1），进而求解包括ΔCp在内的热力学参数，直接研究水合（疏水）作用对四肽构象变化的ΔCp的影响。研究发现两个4CN-Trp侧链的疏水相互作用使得ΔCp为正值（约543 J K-1 mol-1；图1，从open构象变到closed构象），而且这种疏水相互作用在电子激发态下被增强。这项研究成果有助于深入理解蛋白质折叠机制，为调控蛋白质疏水性和折叠/解折叠过程提供了研究基础，为设计高温折叠蛋白或低温解折叠蛋白提供了一种潜在的策略。
图1. GWCNWCNG展开-折叠的构象比例随温度变化示意图。
4CN-Trp是天然色氨酸的衍生物，在水溶液中具有较长的荧光寿命（>12 ns）和较高的量子产率（>0.8）。在GWCNWCNG中，4CN-Trp的荧光会因为与另外一个4CN-Trp之间的光致电荷转移反应而淬灭，其效率对两个WCN侧链间的距离高度敏感，因此可以通过测量4CN-Trp的时间分辨荧光光谱研究水溶液中短肽的构象变化。室温下GWCNWCNG在水溶液中的荧光以双指数衰减，寿命分别为11.7 ns和3.5 ns，占比分别为0.83与0.17，这表明四肽可能主要以两种构象存在于水溶液中。这一结论得到了MD模拟与DFT计算的支持。模拟的结果表明，GWCNWCNG在水溶液中主要存在两种构象集合（图2）：一种是两个WCN侧链彼此分开，距离较远（展开构象，open），另一种是两个WCN侧链彼此接近形成相互作用对（折叠构象，closed）。
图2. (A) GWCNWCNG的MD模拟中两个WCN侧链之间的距离（dcm）。(B) 在 295 和 350 K下dcm的分布图。
温度变化可以移动两个构象之间的平衡，改变它们的相对占比，进而影响荧光衰减的动力学性质。研究人员在多个温度下（5 ℃~80 ℃）测量GWCNWCNG水溶液的时间分辨荧光，并与只有一个WCN侧链的三肽GWCNG的研究结果进行比较。GWCNG的荧光寿命（τ0）基本不随温度变化，而GWCNWCNG中两衰减组分的寿命（τ1，τ2）、以及所占比例（A1，A2）随温度变化明显（图3）。
图3. (A) GWCNG和 GWCNWCNG的荧光衰减寿命的温度依赖性。(B) GWCNWCNG的两个荧光衰减组分占比的温度依赖性。
研究人员建立了荧光衰减动力学模型（图4A），结合过渡态理论并依据自由能与比热容之间的关系求解动力学方程，对基态的平衡常数、自由能变化和激发态构象变化速率进行了拟合（图4B，C和D），进而得到基态和激发态GWCNWCNG展开-折叠的构象转变的比热容变化。结果表明，在基态，GWCNWCNG展开-折叠构象转变时伴随着比热容的大幅增加（约543 J K-1 mol-1）；而在激发态，展开-折叠构象转变在约80ns的时间尺度上（室温），展开构象与过渡态间的比热容变化为负值（约 −734 J K-1 mol-1）。这些结果挑战了以往对于蛋白质折叠中疏水效应的理论认知，即蛋白质的折叠往往伴随着疏水性残基之间更加紧密的相互作用，因而导致其暴露在水溶液中的疏水面积的减少，从而导致比热容的减小。而这很大程度上可能与4CN-Trp特殊的疏水性有关，即4CN-Trp虽然与Trp结构类似，氰基（CN）的存在使得4CN-Trp与Trp相比能够形成额外的氢键，进而表现出反常的性质。
图4. (A) GWCNWCNG的荧光衰减动力学模型。(B) GWCNWCNG基态构象变化平衡常数的温度依赖性。(C) 激发态构象变化速率的温度依赖性。(D) 激发态构象变化的自由能垒的温度依赖性。
总结与展望
该研究采用荧光光谱、MD模拟和DFT计算研究了短肽GWCNWCNG的构象分布和转变。研究发现该肽存在两个构象。随温度升高，更紧凑且溶剂可及表面积更小的构象所占的比例增加。基态平衡常数随温度变化的结果表明展开-折叠的比热容变化（ΔCp）为正，这挑战了传统观点中，非极性表面减少导致负比热容变化的观点。这项工作表明，通过在天然的氨基酸结构上进行修饰（例如氰基修饰），微调芳香族残基的疏水性，可以进一步改变蛋白质或多肽的热力学性质。这项研究成果有助于深入理解蛋白质折叠机制，为调控蛋白质疏水性和折叠/解折叠过程提供了研究基础，为设计高温折叠蛋白或低温解折叠蛋白序列提供了一种潜在的策略。
相关论文发表在 J. Phys. Chem. Lett. 上，北京大学博士研究生王曼茜、博士后庄勃、博士研究生汤凯麟为文章的共同第一作者，盖锋教授为通讯作者。
通讯作者信息
盖锋（Feng Gai）教授，博士生导师
研究方向：物理化学，生物物理，分子光谱
研究领域及兴趣：应用基于分子振动和电子跃迁的线性和非线性光谱技术在分子层面上研究生物大分子的折叠机理、结构、构象动力学、功能以及它们之间的关系。
电子信箱：fgai@pku.edu.cn
课题组网站:www.chem.pku.edu.cn/gailab
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J. Phys. Chem. Lett. 2024, 15, 47, 11723–11729
Publication Date: November 15, 2024
https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.4c02842
© 2024 American Chemical Society
Editor-in-Chief
Gregory D. Scholes
Princeton University
The Journal of Physical Chemistry Letters 致力于报道物理化学家、生物物理化学家、化学物理学家、物理学家、材料科学家和工程师感兴趣的新的和原创的实验和理论基础研究。
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