Nature Catalysis：检测全新氢物种！
学术
2024-12-20 20:37
上海
氢酶是一种非常广泛的金属酶，能够用于氢气分子的活化和制备氢气分子。理解氢酶的催化反应机理有助于工业生物催化进行氢气和制备和转化。有鉴于此，马克斯·普朗克多学科科学研究所Stefan Glöggler、Christian
Griesinger、马克斯·普朗克陆地微生物研究所Seigo Shima等研究[Fe]-hydeogenase在催化反应过程中，发现以往研究中未曾检测到的氢中间体物种。作者通过仲氢的信号增强NMR技术，实现检测这种中间体。在不同的核自旋态下，分子氢气能够形成仲氢（parahydrogen）或者正氢（orthohydrogen）。作者发现[Fe]-氢酶催化转化仲氢产生显著增强NMR信号（这是因为仲氢能够增强极化的效应，PHIP），这种NMR信号代表了[Fe]-氢酶在催化反应过程如何结合氢气分子。研究数据的结果表明，催化反应过程中，Fe催化活性位点上形成了负氢。PHIP效应能够研究氢气的结合动力学。这项研究结果表明PHIP技术对于研究氢酶催化机理具有未曾关注和报道的能力。首先观测发现甲烷杆菌（Methanocaldococcus jannaschii）来源的重构Hmd holoenzyme和反应物（methenyl-H4MPT+）在使用p-H2处理后，立刻形成1H NMR信号（图1）。但是，使用正常的氢气（n-H2，核自旋处于室温热力学平衡态的H2）处理，只发现热力学极化的溶解H2分子的单峰，没有发现溶解的HD信号。当使用p-H2处理，发现HD三重态的信号增强，并且产生混合的H2信号。![]()
图2. H2溶解在含有[Fe]-氢酶的溶液中的1H-PHIP效应当浓度为1 μM jHmd的样品进行重复的PHIP实验，发现H2和HD都产生明显的信号增强，这个结果表明PHIP效应（PHIP, parahydrogen-induced polarization (仲氢激发极化)）的灵敏度非常高。这种信号增强只出现在同时存在jHmd和methenyl-H4MPT+反应物同时存在的情况，此外，PHIP随温度和pD的变化与酶活性高的区域符合。而且，当His14被突变为丙氨酸，这种PHIP效应消失，这个现象表明PHIP效应与Hmd催化有关，并且His14是产生PHIP效应所必须的。同位素标记实验（2H、13C、57Fe）说明PHIP过程只含有p-H2的两种自旋。PHIP对H2和HD的影响的两种机理都来自相干自旋。对于H2-PHIP和HD-PHIP两种情况，都需要将p-H2加入催化活性位点形成酶结合的状态，在这种与酶结合的情况下，两个氢原子是不等价的，而且仍然具有J耦合。H2-PHIP机理。H2-PHIP效应是通过H2可逆的形成酶结合的状态，并且形成部分负线形效应（PNL, partially negative line shape）。从信号的相位看，H2分子的两个质子需要产生正JHH耦合才可能形成PNL效应。当产生配位作用后，仲氢转化为正氢，这个过程能够观测发现信号增强PNL。HD-PHIP机理。与H2-PHIP相同的，HD-PHIP机理是因为结合在酶催化位点的瞬态形成的强J耦合作用导致分子的自旋演变，但是HD-PHIP还需要HD分子与溶剂分子之间的氢同位素交换。在低磁场下（1 mT~7.1 T），随磁场变化的信号与强J耦合机理（被称为oneH-PHIP、NEPTUN）相符。在另一种机理，剩余偶极耦合（residual dipolar couplings）能够通过相干演变导致HD分子产生极化，这种效应是通过自动对齐（self-alignment）作用，也被称之为SWAMP效应。当磁场强度增加，RDC应该能够开始起到作用，但是在21.1 T的强磁场测试的结果仍然只和J耦合机理有关。![]()
图3. PHIP效应对水分子的影响而且在HD-PHIP效应的同时，伴随着水分子的超极化现象。这种超极化在Hmd浓度提高和温度升高的情况下发生。在HDO分子观测发现负的氢极化现象（图3），这与HD-PHIP超极化的信号方向相反。Hmd催化异裂p-H2分子能够生成正极化的负氢（H-），随后与D+反应生成HD；p-H2分子生成的正氢（H+）具有负极化，能够从酶催化剂扩散到水溶液。当Hmd酶的位点具有methenyl-H4MPT+反应物分子，超极化的H-能够将反应物还原，生成的methenyl-H4MPT选择性的在(C14a)Hpro-R位点产生超极化。NMR测试发现正的超极化信号，δ(1HC14a,pro-R)lit = 4.9–5.05 ppm，1J(C14a,Hpro-R)lit = 158 Hz。观测发现(C14a)Hpro-R向13C标记的C14a位点转移超极化的现象，与文献报道的结果（δ(13C14a)lit = 69.87 ppm）类似。这个结果表明Hmd催化反应产生的中间体能够对HD、HDO、methenyl-H4MPT产生超极化。而且，当Hmd没有methenyl-H4MPT+和methenyl-H4MPT，所有的PHIP效应都消失，说明需要结合紧密的酶-反应物复合物才能够导致催化反应的发生。![]()
图4. 观测发现(C14a)Hpro-R的1H-PHIP效应![]()
图5. (C14a)Hpro-R向C14a的超极化转移在三个不同静态磁场（B0）分别进行H2-PHIP、HD-PHIP样品单次测试，表征磁场对于结合态的中间体的影响。通过将实验测试NMR数据与自旋动力学模拟结构比较。通过实验观测的同位素交换动力学对动力学参数进行限定，对不同结构模型给出的1H NMR参数进行比较，检测目前提出的机理模型。与目前提出的结合态不同，作者提出的结合模型能偶区分处于结合态的两个氢原子，能够研究同位素交换H+⇄ D+的情况，评估原子交换的反应速率上限（kex）。为了模型的简化，在pD 6.0测试氢同位素交换动力学，因为在这个状态的整体动力学同位素效应非常低，因此能够忽略动力学同位素效应。通过量子力学/分子力学（QM/MM）优化了Hmd模型，计算了1H化学位移和1H-1H J耦合交换常数（JHH）。![]()
图6. 优化的Hmd催化反应循环在没有损失的条件下模拟自旋动力学，模拟得到H2和HD的PHIP信号与预期相符，而且观测验证了B0变化对信号的影响，验证了强度的上限。PHIP对H2的影响结果表明，处于结合态的两个氢原子的化学位移δav = 3.5–5.0 ppm，时间平均JHH耦合的JPNL≥10
Hz，与测试得到的JPNL=50-300 Hz相符。结合在酶上的最可靠结构是4号结构，在这种情况下，H2通过氧吡啶（oxypyridine）而不是SCys176活化，这是因为较强的JHH耦合作用，而且化学位移与计算结果匹配更好。根据4号结构的模型A2模拟光谱结构，得到中间体的寿命约为16 μS。对于模型A1，3号结构的PNL与NMR结果非常好的相符。对于这个模型能够完美的实现模拟光谱和实验测试光谱的匹配。此外，作者发现Fe-η2-H2物种结构3不可能产生PNL雄安英，因为二氢配体的氢原子交换非常迅速，阻碍了这种配体仲的PHIP效应。二氢配体与结构3的氧吡啶配体之间的相互作用导致旋转的能垒比质子化状态的能垒更高，但是仍然不可能完全阻止结构3的PHIP效应。因此作者认为结构4是最可能导致产生PNL效应的原因。这个研究结果表明形成Fe-H的步骤不是反应决速步骤（与动力学同位素效应的研究结果一致），表明Hmd还原CH≡H4MPT+反应的决速步骤不是H2活化。当考虑了两种结合态的组装体，HD-PHIP和H2-PHIP信号以及同位素交换动力学都能够在计算模拟中重现。因此提出的模型如图6所示，其中在氢气活化后形成寿命较短的中间体Fe-H（结构4），随后这个中间体进一步反应生成寿命更长的中间体（结构5），这个中间体能够发生氢同位素交换，生成超极化的HD和HDO。![]()
图7. 考虑了PNL、HD-PHIP、同位素交换动力学的模型![]()
图8. 通过超极化CEST实验表征反应中间体PHIP效应能够描述实验观测的催化反应循环释放的产物，以及溶液中检测的产物。从这些信号能够得到氢如何结合在催化位点的状态，这是因为PHIP效应，而且氢原子结合在催化活性位点。由于检测线的展宽比较窄，而且超极化产物能够在溶液中累积，因此具有缓慢1H弛豫的样品测试具有最高的灵敏度。将PHIP实验和化学交换饱和转移CEST（chemical exchange saturation transfer）进行结合，得到PHIP-CEST表征方法。其中，CEST能够通过与丰富的物种之间化学交换，间接的测试产生的低浓度瞬态物种，并且结合态的中间体能够对产物进行饱和转移因此间接的检测低浓度瞬态中间体。而且通过超极化作用进一步增强CEST方法的灵敏度。通过PHIP-CEST方法检测Hmd系统，发现CEST效应产生交替的H2和HD信号，而且H2信号的形状随着CEST频率的变化而改变。H2信号的形状从PNL变成符号切换的同相信号，随后再回到PNL。CEST效应在0.5~1 kHz饱和，能够认为中间体的寿命为τPHIP-CEST ≈ 1−2 ms。在H2和HD-PHIP信号的相似位置能够发现两个CEST效应。其中10.5 ppm的CEST效应对应于酸性质子的化学位移。第二种CEST效应与自由氢的共振饱和（4.6 ppm），因此无法精确这种CEST效应的位移，只得到粗略的位置在3±3 ppm。需要注意的一点是，在δH <-10 ppm没有明显的PHIP-CEST效应，这与金属负氢物种的特点相符，与氢化物的化学位移计算结果相符。通过理论计算能够复现PHIP-CEST曲线，其中在10.5 ppm和4 ppm的化学位移，在10.5 ppm具有D2O的同位素交换信号，这个10.5 ppm的信号与FeGP的吡啶醇化学位移相符，而且根据相关证据表明这是比较可靠的信号归属。为了重复PHIP-CEST数据，需要p-H2分子的两个氢原子之间的负JHH耦合。因此含有JHH<0的中间体参与了Hmd酶催化反应过程。PHIP-CEST的寿命估算结果（τPHIP-CEST≈ 1~2 ms）与同位素交换的结合态拟合结果（τ同位素交换=(kd+kHD+kex)-1≈1.7 ms）相符合。这个结果说明中间体在同位素交换前发生积累。因为PHIP-CEST效应得到的数据与计算的化学位移很好的匹配，考虑了反应轨迹进行计算的吡啶醇和CH2=H4MPT的(C14a)Hpro-R负耦合JHH相符，而且反应中间体是5的可能性最高。这项研究展示了通过增强灵敏度NMR测试方法研究氢酶催化反应中间体。这项研究首次将NMR技术用于研究抗磁性金属酶，特别适合用于研究催化反应过程中的瞬态氢中间体。这是因为结合在催化位点的氢物种选择性信号增强。研究这种结合的氢物种，尤其是抗磁性中间体，对于目前的技术仍是个挑战。而且，这项研究和方法为生理学测试提供帮助。这项研究能够作为研究氢酶以及氢酶相关模型催化剂的机理。此外，这个技术具有高灵敏度，因此能够用于研究微生物细胞，能够用于研究体内的氢代谢过程。这项技术为研究氢酶活化的机理提供帮助，有助于调控氢气（生物）催化，提高氢气产量和氢气转化率。Kaltschnee,
L., Pravdivtsev, A.N., Gehl, M.et al. Parahydrogen-enhanced
magnetic resonance identification of intermediates in [Fe]-hydrogenase
catalysis. Nat Catal (2024).DOI:
10.1038/s41929-024-01262-whttps://www.nature.com/articles/s41929-024-01262-w
