Nature Catalysis：光+酶催化！
学术
2025-01-01 21:13
上海
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光催化-酶催化NHPI酯脱羧叠氮化/硫氰酸酯化的示意图最近由于生物催化反应能够将非生物有关的反应物转化，因此自然催化的能力得到拓展。但是这类引入的新型催化反应只代表催化合成领域的很小一部分。有鉴于此，约翰霍普金斯大学黄雄怡(Xiongyi Huang)、卡内基梅隆大学Yisong Guo、西班牙赫罗纳大学Marc Garcia-Borràs等报道将光催化和金属酶催化剂结合，构建能够进行自由基催化转化的生物催化反应平台。这种光催化-金属酶催化反应体系使用eosin Y光催化剂，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenases）作为金属酶催化剂，绿光作为光源，实现了N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯NHPI（N-hydroxyphthalimide esters）的对映选择性脱羧叠氮化反应和脱羧硫氰酸化反应。通过酶的定向进化技术优化的多种变体能够得到各种手性有机叠氮化合物和硫氰酸酯化合物，产率达到77 %，TON达到385，立体选择性达到94 % e.e.。反应机理研究表明，eosin
Y光催化剂能够生成C(sp3)自由基和Fe(III)-N3/Fe(III)-NCS中间体，高效率的在酶催化活性位点立体选择性构筑C-N3化学键和C-SCN化学键。这项研究和发现开发了一种具有适应性的生物催化平台，能够将非生物的金属光催化剂引入生物学。酶催化的设计。作者推测能够找到一种活性位点能够结合NHPI酯分子的金属酶、找到一种具有合适的氧化还原性质的光催化剂能够同时活化Fe(II)位点和NHPI酯化合物是这种光酶催化反应的关键挑战。对多个非血红素Fe酶和光催化剂进行初筛，确定了对设计反应具有催化活性的组合（图2a和SI表格Table 1）。发现链霉菌（SavHPPD, Streptomyces avermitilis）来源的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶和eosin Y作为光催化剂，具有最有前景的催化活性。在绿色光照射下，这种光酶结合催化的TTN（总转化数目）达到140，立体选择性e.r.达到70:30。通过一系列条件控制实验验证反应的发生，当没有光或者光催化剂的时候，反应无法生成叠氮化产物。当反应体系没有加入酶催化剂，只生成少量的消旋叠氮化合物产物（溶液中的Fe(II)催化产生）。将SavHPPD的两个Fe配位组氨酸（his）突变为丙氨酸（ala），发现只能生成痕量产物。这些条件控制实验的结果表明，该反应在酶催化活性位点进行，并且酶催化位点控制反应的立体选择性。通过定向进化技术改善光酶催化反应的立体选择性。选择反应物对接位点的7个基团继续宁位点饱和突变（SSM）和筛选（图2b）。对V189位点进行突变，发现得到的SavHPPD V189A突变体能够改善酶催化活性（TTN达到240）和立体选择性（达到73:27 e.r.）。随后对SavHPPD V189A进一步突变和筛选，发现S230Y突变体使得产物的e.r.改善两倍。这种改善效果可能是因为形成的酶催化活性位点产生更好的疏水性，有助于反应物自由基接近Fe(III)-N3中间体并且生成C-N3化学键。随后，对SavHPPD V189A/S230Y进一步的位点饱和突变，得到四重突变体SavHPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A，在催化反应中实现了200 TTN和94:6 e.r.立体选择性，将这个突变体记作SavHPPD-PC。发现该反应主要产生的副产物是异氰酸酯，这有可能因为非酶催化Curtius重排反应的原因。在定向进化过程中N3/NCO产物比例改善的原因是叠氮化反应的酶催化活性增强。通过SavHPPD-PC进行进一步反应条件优化，增强反应产率和N3/NCO比例。通过改变光强度、反应物浓度、NaN3浓度、酶催化剂用量、缓冲液浓度，发现当SavHPPD-PC的浓度为0.2 mol %，叠氮化产物1的产量达到77 %，N3/NCO的比例达到8.4，而且产物的立体选择性仍能够达到94:6 e.r.。图3. 光酶催化脱羧叠氮化、脱羧氰基化反应的兼容性在优化的反应条件，测试光酶催化反应的反应物兼容性（图3）。苯环含有卤素、甲基、甲氧基的反应物有着比较好的兼容性，产物TTN达到385，立体选择性e.r.达到97:3。但是含有异丙基、三氟甲基的反应物没有反应活性，这是因为酶催化活性位点的立体位阻导致。P243, S230, F364, L367, F336形成的疏水口袋用于容纳反应物的芳环，芳环的邻位、对位、间位与这些基团接近（距离小于4 Å），具有一定的芳环取代基容忍性。三氟甲基的电子结构对反应性有影响，说明取代基的电子效应对反应的影响。含有苯并畴环结构的化合物能够兼容（15和16）。该反应能够扩大量至0.1 mmol量级，以53 %的收率生成产物1，且产物的立体选择性没有降低。苄基碳原子含有烷基取代基的反应物（17-19）同样兼容，TTN达到82-200，立体选择性达到73:27-94:6 e.r.。立体位阻效应对美催化活性和立体选择性产生显著的降低（17和18），30-NHPI和31-NHPI没有产物生成。这有可能是因为酶催化位点的空间限制所导致。一级、二级、三级脂肪酸的NHPI酯的兼容性。这些脂肪酸NHPI酯具有挑战性的原因是生成响应羧酸自由基的脱羧反应速率更加缓慢，而且产生的C(sp3)自由基稳定性更低。研究结果表明，对于这些具有挑战性的反应物（20-24），TTN能够达到27-124，其中23生成二级叠氮化合物的立体选择性达到77:23 e.r.。而且通过不加入酶的控制实验，验证了22-24反应来自酶催化。对偶联性官能团的兼容。引入具有偶联供能的官能团（胺、醇、卤素、准卤素），拓展该反应的种类和兼容。引入的取代基大多数无法生成目标产物，作者认为这种现象是因为偶联官能团导致反应物无法结合在SavHPPD的Fe中心位点。但是，对硫氰酸酯（25-29）具有反应性，TTN达到45-114，立体选择性达到56:44-78:22 e.r.。虽然对映选择性并不是特别优秀，但是说明生物催化自由基转化构筑C(sp3)-CSN化合物是具有前景的反应，突出了这种生物催化金属-光催化策略对于开发新型金属酶自由基反应的前景。通过一系列实验，深入理解该反应的反应机理。首先，监控随着反应时间的增加，反应e.r.选择性的变化情况。结果发现产物1的e.r.选择性一直保持94:6，反应物没有立体结构，还是保持消旋态。这个结果表明酶催化剂能够与(R)-1-NHPI和(S)-1-NHPI结合，并且将其转化为立体结构的自由基，通过分子动力学模拟（MD）验证这一点。随后通过ESR表征，研究Fe(III)中间体的形成。当没有加入1-NHPI，在光照射下只有少量Fe(III)生成，当加入1-NHPI，发现Fe(III)的量显著增加。这个结果说明，1-NHPI作为牺牲电子受体，将还原的eosin Y淬灭，因此显著增加Fe(III)的数量。通过Stern-Volmer实验进一步研究eosin Y光催化剂、Fe(II)、1-NHPI之间的SET过程。通过分子动力学模拟和反应物对接模拟表明eosin Y在SavHPPD PC的结合位点富含赖氨酸（lys）和精氨酸（arg），这与eosin Y与极性基团具有结合相互作用的认识符合。结合位点都分布在SavHPPC-PC的Fe位点相邻20 Å范围内，验证了Fe和eosin Y之间的直接电子转移的可能性。通过以上研究，提出了可能的催化反应过程。虽然目前仍然无法排除催化循环1的可能性，但是以上研究结果说明反应催化循环更符合2循环。其中激发态eosin Y将Fe(II)氧化为Fe(III)，随后还原后的eosin Y活化NHPI酯。这个过程与eosin Y的高还原电势相符（Ered1/2(EY*/EY•‒) = +0.83 V，CH3CN/H2O 1:1），与Fe(II)位点的低电极电势相符（Em(FeIII/FeII) = −0.3 V to +0.3 V）。这项研究展示了一种适应性的策略，将光催化产生自由基、非血红素Fe酶立体选择性的捕获自由基结合，开发了立体选择性的酶催化反应。这种方法中，通过eosin Y光催化剂的帮助，对NHPI酯光化学脱羧反应，SavHPPD的非血红素Fe酶位点成为脱羧叠氮化的催化剂。这个酶催化反应平台的多功能，将叠氮官能团替换为硫氰酸酯官能团，用于脱羧硫氰化转化。反应机理研究结果表明，该反应首先通过eosin Y光催化剂将Fe(II)氧化为Fe(III)，随后eosin Y对NHPI酯再次发生SET，生成C(sp3)自由基。这个反应过程是通过光催化剂结合在蛋白表面实现的，光催化剂结合在蛋白表面，能够分布于Fe位点的20 Å距离内，实现长程的电子转移。作者认为这种光酶催化反应方法拓展了生物催化的应用，将各种各样的光催化剂自由基产生方法用于金属酶催化反应。Rui, J.,
Mu, X., Soler, J.et al. Merging photoredox with
metalloenzymatic catalysis for enantioselective decarboxylative C(sp3)‒N3 and C(sp3)‒SCN bond formation. Nat Catal 7, 1394–1403
(2024).DOI: 10.1038/s41929-024-01257-7https://www.nature.com/articles/s41929-024-01257-7
