文献解读 | 铜绿假单胞菌的进化与宿主特异性适应

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）会导致人类多重耐药性感染，特别是在患有免疫缺陷或炎性肺病（如囊性纤维化）的患者中。然而，目前尚不清楚铜绿假单胞菌如何演变成一种高度适应性、全球传播的病原体。

我们的研究揭示了铜绿假单胞菌从环境生物进化为主要人类病原体的关键连续步骤。这些步骤包括：通过水平基因转移引发的跳跃式进化，生成流行克隆 → 这些克隆的内在宿主偏好，这与特定的转录变化有关，使其能够在巨噬细胞内生存 → 多轮收敛的宿主特异性适应：最终导致其失去在不同患者群体间传播的能力。因此，我们的研究强调了全球监测和交叉感染预防在防止未来流行克隆出现中的重要性。

主要人类病原菌铜绿假单胞菌在免疫缺陷或结构性肺病（如囊性纤维化，CF）患者中引起多重耐药感染。我们的研究显示，少数环境分离株通过水平基因获取，已成为主导的流行克隆，并在过去200年间通过全球传播网络依次出现和传播。这些克隆展示了感染CF或non-CF个体的内在倾向（与在巨噬细胞内生存的特定转录变化有关）；经历了多轮收敛的宿主特异性适应；并最终失去了在不同患者群体间传播的能力。因此，我们的研究解释了铜绿假单胞菌的致病进化，强调了全球监测和预防交叉感染在防止未来流行克隆出现中的重要性。

引言

我们首先分析了全球分布的9829株人类、动物或环境来源的铜绿假单胞菌分离株，其中包括来自2765名患者的9573份人类临床样本（图1A），基于成对单核苷酸多态性（SNP）距离，我们将这些分离株划分为596个遗传相关克隆，然后根据每个克隆感染的患者数量进行了分层（图1B）。鉴定出的主要克隆有21个，每个克隆至少包含来自30个个体的分离株，我们将其称为“流行”克隆，并通过其主要MLST来指称它们。

我们发现这些流行克隆在感染的人类中比在非建筑环境中更有可能被检测到，它们造成了全球51%的铜绿假单胞菌临床感染，广泛分布在系统发育树上，并且在全球范围内传播（图1C）。

图1 铜绿假单胞菌流行克隆的出现（A. 铜绿假单胞菌全基因组测序分离株的地理位置；B. 铜绿假单胞菌克隆间的累积分离株数；C. 左：由所有研究分离株基因组生成的最大似然系统发育树; D. 利用BEAST进行贝叶斯推断预测的21个流行克隆首次种群扩张的估计时间；E. 使用Panaroo构建的流行克隆（n = 21）和散发性克隆（n = 80）祖先代表的泛基因组图分析）

2、推断群体扩张和和流行克隆随时间的地理分布

由于我们的样本收集跨越了超过100年（从1900年至2018年），我们想知道是否可以使用贝叶斯时间重建法来探索流行克隆的历史起源。我们估计流行克隆在17世纪末到20世纪末之间非同步出现），并通过Skyline人口统计模型推断它们在1850年至2000年之间至少经历了一次主要的群体扩张（图1D）。仅考虑现存的克隆，这些结果表明P. aeruginosa在相对近期内经历了宿主-病原体动态的变化，可能是由人类人口密度的变化、迁移模式和/或例如工业化期间空气污染增加导致的感染易感性增加。

对于地理上成簇聚类的流行克隆，我们实施了贝叶斯系统地理学方法来推断克隆的祖先位置，同时接受我们机会性样本收集的局限性。对于某些克隆，如ST235，我们能够找到支持从南美洲到北美洲和欧洲，然后随后到亚洲和非洲的洲际传播方向的统计证据，而对于其他克隆，如ST17和ST27，我们只能确定传播限制在欧洲和北美洲之间，并在20世纪下半叶达到顶峰。我们得出结论，流行克隆很可能起源于分布在世界各地的祖先位置。

接下来，我们研究了为什么一些铜绿假单胞菌克隆会流行，并研究了通过水平转移获得的基因是否可能通过跳跃进化（saltational evolution）驱动人类感染性的大幅跳跃。跳跃进化被定义为由突然的大幅度的遗传变化引起的进化适应性的突变，正如之前在脓肿分枝杆菌中观察到的那样。为了准确分析铜绿假单胞菌的附属基因组，我们首先使用Panaroo推断了一个泛基因组图，其中节点是直系同源基因簇，如果在任何重叠群中发现相邻的节点，则两个节点通过边连接（图1E）。然后，我们将祖先流行克隆代表与散发分离物的辅助基因组进行了比较，发现流行克隆中涉及转录调控、无机离子转运、脂质代谢和蛋白质周转的基因显著富集，涉及细菌防御和分泌的基因显著缺失，这表明细菌生理学的基本变化可能推动了流行克隆的发展。

接下来，我们研究了由流行克隆引起的人类感染类型，发现ST146（也称为LES）几乎只在CF患者中引起感染。相反，一些克隆，如ST175和ST309，仅在non-CFCF个体中引起感染，而其他克隆存在一系列CF和non-CF的宿主分布（图2A）。尽管我们的样本是机会性收集的，但当重新分析现有的系统性英国监测数据时，我们的发现与每个流行克隆引起的CF和non-CF肺部感染的频率相一致。我们假设这种明显的克隆特异性宿主偏好可能与克隆间细菌行为的内在差异有关。泛基因组分析显示，没有证据表明宿主亲和力与特定功能基因的获得有关，所以我们推测基因表达的变化可能解释宿主偏好性的差异。因此，我们分析了一项先前关于临床铜绿假单胞菌分离株的转录组学研究，这些分离株几乎都来自non-CF患者，并发现临床分离株根据流行克隆的宿主偏好，在转录空间中聚集（图2B）。

我们接着探讨了是否存在与特定人类宿主的克隆易感性相关的基因表达模式，并使用负二项广义线性模型，确定了624个基因的明确表达特征，这些基因与引起CF感染的亲和力呈正相关，514个基因呈负相关（Wald检验，FDR=0.05；图2C和表S3）。

图2 流行铜绿假单胞菌克隆的可变内在宿主偏好（A. CF（红色）和non-CF（蓝色）患者中由MLST标记的流行克隆引起的感染比例；B. 流行克隆代表性分离株的转录组UMAP投影，用每个克隆的CF亲和力进行颜色编码；C. 基因表达与CF亲和力的全转录组关联; D. 感染2h和4h后，WT或等基因F508del敲入THP1巨噬细胞内的流行克隆存活率，以感染后1小时的倍数变化表示，显示中位数和IQR（箱形图）和1.5倍IQR范围（须状））

为了确定差异基因表达改变流行克隆宿主偏好的潜在机制，我们对49个代表性分离株进行了多维表型特征分析，它们几乎都来自non-CF患者，以最小化次生宿主特异性适应的贡献。这些分离株包含低（ST235和ST111）、中（ST253）和高（ST17、ST27和ST146）水平的流行克隆，从国际假单胞菌联盟数据库中获得。我们最初通过已建立的假单胞菌毒力测定检查了分离株的行为（生物膜形成、铁载体产生、游动和收缩运动以及酪酶和明胶酶的产生），但我们没有发现与克隆宿主亲和力的相关性。

因此，我们决定测试不同流行克隆的代表分离株抵御巨噬细胞内杀伤的能力，巨噬细胞与中性粒细胞一起被认为是抵抗细菌肺部感染的第一道防线。我们发现，与来自低亲和力（ST111和ST235）克隆的分离株相比，来自高CF亲和力克隆（ST27）的分离株在野生型（WT）和CF（F508del纯合子）同源巨噬细胞系中表现出显著增加的细胞内生存和复制能力（图2D）。这表明宿主固有免疫逃避能力的增强可能解释了特定流行克隆在感染CF患者中的内在成功。

为了进一步探究高CF亲和力克隆中分离出的细菌菌株增强的细胞内生存机制，我们研究了差异表达基因集（图2C），发现严格应答调节因子DksA1的表达及其调控网络的激活都与CF亲和力相关（图3A）。由于DksA1先前已被认为与增强铜绿假单胞菌在鼠巨噬细胞内的生存能力和提高对H2O2的耐受性有关，我们通过使用non-CF和CF感染的体外和体内模型，以及铜绿假单胞菌PAO1野生型及其同源DksA1和DksA2双敲除（ΔDksA1,2）和互补（ΔDksA1,2::DksA1）菌株，来研究敲除DksA1对细菌生存的影响。使用ΔDksA1,2双敲除突变体是因为基因的冗余。

我们首先在巨噬细胞中测试了细菌的存活情况，发现尽管三个菌株在野生型THP1巨噬细胞中都被有效杀死，但只有ΔDksA1,2菌株能被同源CF（F508del敲入）细胞杀死，而野生型和补偿型细菌能够抵抗巨噬细胞杀伤并在细胞内复制（图3B）。我们的发现揭示了宿主-铜绿假单胞菌相互作用的一些重要特征。首先，它们表明CF巨噬细胞存在内在缺陷，有利于铜绿假单胞菌在细胞内存活，这些观察结果得到了之前的体外报告以及我们在斑马鱼体内的实验支持，其中CF跨膜调节因子（cftr）基因的敲除或形态素敲低会使得静脉感染后的存活率降低。

其次，我们的发现表明，CF巨噬细胞内的存活是由DskA1介导的，这对严谨反应在吞噬体环境中存活的作用机制提出了有趣的疑问。最后，我们的结果表明，不同流行克隆间DskA1表达的差异可能解释了它们在巨噬细胞内存活能力的差异，以及可能因此而产生不同的内在宿主偏好性。

为了进一步探索DksA1的潜力在用，我们研究了在斑马鱼幼体体内感染期间，荧光标记的野生型(WT)、ΔDksA1,2突变体以及补偿型铜绿假单胞菌PAO1的行为（图3，C至G）。结果发现，对照组和经过cftr morpholino处理的鱼感染ΔDksA1,2细菌的存活率相较于感染野生型和补偿型菌株更高（图3D），这一发现与观察到的ΔDksA1,2细菌体内存活率降低的结果一致（图3E）。

然后，我们利用斑马鱼幼体的透光性，通过活体共聚焦显微镜跟踪了肌内感染铜绿假单胞菌后与巨噬细胞的相互作用情况。使用一种荧光巨噬细胞报告鱼系，Tg(mpeg1:mcherry-F)ump2，我们能够清楚地识别出巨噬细胞，并区分细胞外和细胞内的荧光细菌（图3F）。我们发现，感染WT、ΔDDksA1,2突变体或补偿铜绿假单胞菌PAO1细菌的对照组鱼和cftr morpholino鱼，它们在巨噬细胞向感染部位的动员或者在感染巨噬细胞的比例上，没有差异。然而，我们确实观察到在ΔDksA1,2感染对照组和cftr morpholino鱼后，巨噬细胞细菌负荷明显减少，这表明细胞内复制减少（图3G），证实了DksA1在铜绿假单胞菌体内感染期间对细胞内生存的关键作用。

总的来说，我们的数据表明，某些流行株内源性地提高DksA1表达水平可能使它们能够利用CF患者潜在的固有免疫缺陷，并采用在巨噬细胞内复制的特定进化策略。

图3 DksA1调节子的激活有助于铜绿假单胞菌克隆对CF宿主的偏好（A. Fortuna等人定义的DskA1调节子正调控基因（红色）和负控制基因（绿色）的log2倍表达随CF比例变化的火山图可视化；B. DksA1促进铜绿假单胞菌在CF巨噬细胞内的存活；C. 上：斑马鱼卡通图，说明了gfp标记的荧光铜绿假单胞菌的注射部位。下：感染1天后斑马鱼幼鱼的代表性荧光和差示干涉对比（DIC）图像刻度条；D. 对照（上）和cftr变异体（cftr MO；下）斑马鱼幼鱼静脉注射感染铜绿假单胞菌PAO1 WT（蓝色）、ΔDDksA1,2敲除（粉色）和ΔDDksA1,2::DksA1回补（黄色）荧光菌株，6天以上存活动物的百分比；E. 三组荧光菌株感染后第1天斑马鱼幼鱼中有活力的铜绿假单胞菌；F. 共聚焦成像的代表性三维重建，显示巨噬细胞（红色）和胞外（灰色）和胞内（绿色）铜绿假单胞菌的自动分类；G. 三组P. aeruginosa荧光菌株感染6小时后，通过观察每个巨噬细胞内细菌相关荧光的体积计算注射部位感染的巨噬细胞数量（左）和细胞内细菌负荷水平（右））

接下来，我们通过分析单个克隆的近期突变历史，研究了铜绿假单胞菌的流行克隆一旦从环境中被选择，是如何通过多轮患者体内进化适应人类宿主的。

通过重建自每个克隆出现以来可能发生的突变，我们发现了趋同分子进化的有力证据，在5641个基因中鉴定出224个基因的总突变负担高于偶然预期（图4A），我们称之为病原适应性（pathoadaptive）基因。如变异效应注释所示，这些病原适应性基因的突变比其他基因中的突变更有可能是非同义和有害的，并且据两种序列保护方法的估计，它们更有可能导致蛋白质功能障碍，这表明病原适应性在很大程度上是由功能丧失突变驱动的。接下来，我们通过使用现有的RNA测序（RNA-seq）数据集实验性地探索了病原适应性突变的功能影响，以检查转录因子变体对先前特征调节子表达的影响。我们发现，在几个转录因子中具有病原适应性变异的临床分离株，其调节子表达水平与对照相比在统计学上有显著的变化。这支持了存在一种普遍的丧失功能进化过程驱动铜绿假单胞菌病原适应性的概念。

我们使用先前发表的信息对这些病原适应性基因中的大多数进行了功能注释，确定其中许多基因在公认的致病过程中发挥了作用，包括生物膜形成、抗生素耐药和脂多糖修饰。病原适应性基因中具有既定功能的基因数量远高于其他基因，这可能反映了它们在铜绿假单胞菌病理学中的核心作用。通过在一系列功能测定从头筛选相关转座子突变体来量化毒力特征，我们实验性地表征了41个病原适应性基因的功能。

接下来通过使用个体P. aeruginosa分离株的适应性基因突变谱，将它们在由224个适应性基因突变的 presence 或 absence 定义的进化空间中进行映射，来研究宿主适应性的本质。我们发现，囊性纤维化（CF）分离株与其他分离株聚类分开，并且积累了更多的突变，这表明CF肺部是一个独特的生态位，与其他肺部或非肺部环境相比，具有不同选择压力（图4B）。

我们发现这些病原适应性基因的产物紧密相连，蛋白质-蛋白质之间的相互作用比偶然预期的要多（string database;图4C），这表明它们可能具有协调的功能作用。我们观察到，在CF分离株中，有54个基因更频繁地发生突变，而在non-CF分离株中，有47个基因更常发现突变。在CF或non-CF更常见的突变基因中，我们使用TopGO进行GO生物学途径富集分析，发现了几个过度表达的通路，这表明作为宿主特异性适应的一部分，不同的功能程序正在被修改（图4C）。例如，CF分离株更有可能发生AlgU突变，AlgU是粘液样的关键调节因子，突变主要发生在sigma-H因子与其负调节蛋白MucA和PcnA之间的界面处，PcnA是一种假定的烟酰胺酶，在蛋白核心或蛋白-蛋白相互作用位点发现突变。相比之下，non-CF分离株更有可能突变LadS，这是一种钙响应的组氨酸激酶，突变集中在N端（感应）和跨膜域，以及假定的胆碱转运蛋白BetT2，其跨膜域内存在断裂螺旋突变。

图4 铜绿假单胞菌的宿主特异性病原适应（A. 曼哈顿图显示了铜绿假单胞菌PAO1所有基因全基因组突变负荷测试的标称P值；B. 基于病原适应性基因获得性突变对分离株宿主适应性的UMAP预测，以病原适应性突变的数量（左）和感染类型（右）进行颜色编码；C. 从STRING数据库中提取的病原适应性基因的蛋白-蛋白相互作用网络）

我们使用祖先状态重建来确定每个病原适应性突变的获得顺序，从而重建每个分离株的进化轨迹。结果显示平均而言，CF分离株（20.5 steps）比non-CF分离株（11.2 steps）具有更长的进化轨迹。通过观察每个进化时间步骤中病原适应性基因的突变频率，我们将基因聚类为具有不同时间特征的五组（图5A），这表明特定基因的突变可能在不同的进化阶段很重要（特别是对抗菌药物的耐药性而言）。

根据上述结果，我们想知道是否特定的病原适应性基因集合可能驱动不同的进化过程，比如宿主特异性适应、人与人之间的传播，或者两者都有。为了研究这个问题，我们通过 examining CF 与非 CF 肺分离株中基因突变的相对频率，来推断每个病原适应性基因对宿主特异性病原适应性的影响；同时，基于至少来自两个患者的分离株中特定基因突变的频率，来评估细菌的传播性。然后，我们利用这些信息创建了一个图，展示了每个病原适应性基因对这些进化过程的贡献（图 5B），并为每个基因标注了之前已知的或实验推导出的功能，或观察到的暂时性突变特征类型（图5C）。

我们发现，一些与病原适应性相关的基因与传播性或宿主特异性病原适应性变化相关，而许多基因与这两个过程都有关系。例如，几个基因的突变，如mvfR和morA，在分离株的进化轨迹早期发生，并与non-CF宿主的适应以及传播性的增加相关，而其他基因的突变，如fusA1和algU，在进化过程中较晚发生，与CF宿主的适应和传播性的降低相关。

另外，因为我们观察到几个病原适应性突变对传播性可能存在负面影响，所以我们研究了病原适应性是否可能导致宿主特化，并导致CF和non-CF个体之间的分离株传播减少。为了探讨这种可能性，我们利用分离株的基因组相关性，绘制了各种长度传播链的SNP成对阈值范围内的传播链数量和比例。我们发现了CF-to-CF患者传播以及non-CF to non-CF患者交叉感染的有力证据，但CF to non-CF的传播非常少见（图5D）。此外，我们在测量个体患者遗传多样性的基础上，以特定的SNP阈值（26个SNP）重建了传播簇，并发现了大小不一的传播簇，但很少有既包含CF患者又包含non-CF患者的（图5E）。因此，看来流行性铜绿假单胞菌克隆的宿主特异性病原适应性限制了不同宿主之间的传播。

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