文献解读 | 多重耐药革兰氏阴性病原菌的耐药异质性：表型、基因型和蛋白质组学分析
学术
科学
2024-10-17 08:30
上海
文章题目：Antimicrobial resistance heterogeneity
among multidrug-resistant Gram-negative pathogens: Phenotypic, genotypic, and
proteomic analysis
文章链接：doi: 10.1073/pnas.2305465120
发表时间：2023.8
发表期刊：Proc Natl Acad Sci U S A
IF：9.4
研究背景：细菌病原体中AMR的增加主要是由于AMR基因的横向获取或基因组自发突变的积累。目前，全球的主要AMR来源于移动β-内酰胺酶、氨基糖苷修饰酶（AMEs）、16S RMTases （16S rRNA甲基转移酶）和质粒介导的黏菌素耐药性的广泛流行。此外，ARGs及其变体的类型在区域和全球水平上都存在地理差异。本研究旨在了解ARGs的遗传异质性，与ARGs相关的功能效力，以及ARGs与临床重要革兰氏阴性菌中不同MGEs的遗传联系。
研究对象：来自印度的203株革兰氏阴性菌分离株
研究方法：药敏检测（AST）、全基因组测序（WGS）、MLST、系统发育分析、泛基因组分析、移动元件分析、LC-MS/MS（SWATH）蛋白质组分析
主要研究内容及结果：
1、革兰氏阴性临床病原体的分布
本研究于2016～2022年从印度不同地点分离了203株革兰氏阴性菌，主要包括大肠埃希菌（n = 35）、肺炎克雷伯菌（n = 49）、铜绿假单胞菌（n = 40）、鲍曼不动杆菌（n = 36）以及鼠伤寒沙门氏菌（n = 28），其它菌株见图1A所示。这些分离株来自侵袭性和非侵袭性感染的不同临床标本（图1B）。图S1 样本收集点示意图
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图1 A.基于16S rRNA序列的最大似然系统发育分析；B.分离株的临床样本来源
2、药敏试验（AST）表型结果
作者针对17种抗菌药物进行AST检测，结果显示鼠伤寒沙门氏菌除氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物以外对其它所有抗菌药物都最为敏感。E.coli、P.
aeruginosa、鲍曼假单胞菌均表现为多重耐药。相当数量的K. pneumoniae具有碳青霉烯耐药性（n = 34/49）。且总体而言，绝大多数（n= 188/203）菌株对至少一种抗菌药物耐药。少量分离株（n =
11/203）对17种药物中的16种存在耐药性。![]()
图S2 基于16S、23S和5S
rRNA序列的最大似然系统发育树及AST耐药谱
3、革兰氏阴性菌耐药决定因素的异质性
菌株耐药基因汇总结果显示除少部分ARGs以外，大多数ARGs具有物种特异性。比如鲍曼假杆菌、P. aeruginosa和K. pneumoniae中分别存在固有耐药基因blaOXA-51、blaPAO和blaSHV。碳青霉烯酶blaNDM主要存在于E.coli中，而K. pneumoniae很少发现blaNDM-1（n = 2）和blaOXA-232 （n = 5）变体。氨基糖苷修饰酶（AMEs）的总体流行率高于16S rRNA甲基转移酶（16S RMTases）。aph(3’)和armA普遍存在于非发酵菌（non-fermenters）中，而aadA和rmtB普遍存在于肠杆菌（Enterobacterales）中。对于大环内酯类ARGs，非发酵菌只含有mphE和msrE，而大多数肠杆菌含有ermB和mphA。此外，ARGs的显著特点还包括P. aeruginosa的catB、dfrB和blaVIM-2优势，P. aeruginosa、K. pneumoniae和肠杆菌的fosA优势以及K. pneumoniae和肠杆菌的oqxA、oqxB优势。有趣的是，仅E.coli同时携带dfrB和sul1/sul2（甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药），其他病原体一般只会携带其中一种。图2 基于16S、23S和5S rRNA序列的最大似然系统发育分析及耐药基因图谱4、病原体特异性耐药决定因素与其MLST谱系有关
E.coli的MLST主要聚集在4个大的STs中（22/35），即ST167、ST410、ST405和ST2083。每个分离株都含有多种ARGs，部分ARGs与特定STs相关。blaCMY和blaCTX-M-15是常见的AmpC和超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因，而blaNDM变体存在于31/35个分离株中。K. pneumoniae共鉴定出19种不同的STs，两个最大的clusters属于ST147和ST14，此外还存在少数clusters如ST395、ST22和ST231。相对来说，K.
pneumoniae获得性耐药基因的情况没有E.coli那么严重。其中ST147似乎含有更多的ARGs种类，包括blaTEM、blaOXA-232等。此外，K.
pneumoniae携带有AMEs或16S RMTases基因，但没有分离株同时携带该两者，且16S RMTases具有ST特异性。P.
aeruginosa共鉴定出8种不同的STs，其中最常见的4种分别是ST1047、ST357、ST316和ST664。其中ST357包含blaVEB、rmtB、tetA和cmlA等多个ARGs。此外，很少有P. aeruginosa分离株同时存在dfrB和sul1/sul2基因，从而表现甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药。A. baumannii共鉴定出8种不同的已知STs，主要是ST2和ST164。所有ST164分离株均含有blaCARB和blaOXA-91，但没有其他ARGs。与其他ST相比，ST2具有多重耐药的特点。固有耐药基因blaOXA-51至少存在9种变体，它们对ST特异。而获得性耐药基因blaOXA-23变体，存在于所有已知STs的分离株中。![]()
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图S3-S6 基于E.coli、K. pneumoniae、P. aeruginosa或A. baumannii的7个管家基因的最大似然系统发育分析及耐药基因图谱
5、系统地理学分析揭示了菌株地理特异性谱系的多样性
使用印度分离株和全球收集的代表性E.coli、K.
pneumoniae、P. aeruginosa和A.
baumannii，总共2720个革兰氏阴性细菌基因组，包括203个研究分离株，进行了基于WGS的流行病学分析。E.coli的全球系统地理分析显示，这些基因组可分为8个系统群（A、B1、B2、C-G）（图3A）。本研究的尿路致病性分离株（n=22）以系统群A和B1为主，其次是B2、C、D和F系统群，而在收集的全球参考株中，系统群B2为优势群体。E.coli高度多样化的基因组性质导致无法确定任何具有高地理流行率的主要谱系。K. pneumoniae具有高度克隆性和地理特异性。如图3B所示，大多数印度分离株被划分为5种不同的STs（ST14、ST231、ST147、ST101和ST395)，它们占据主导地位，且具有地方性特征。这些菌株还含有多种AMR基因，包括blaNDM和blaOXA-48-like。根据系统发育关系，大多数研究分离株位于2016-2022年时期的印度参考株附近。这种密切的遗传相关性表明，某些与抗菌药物耐药性相关的STs或谱系具有区域优势、持久性和循环性。P. aeruginosa全球代表性基因组五个系统群及研究分离株的种群结构显示出不同的谱系（图4A）。Group1和Group2占所有分离株的90%以上，其次是Group3至Group5。研究分离株主要聚集在Group2（n = 31）中，其次是Group1（n = 9）。其中phylogroup 1大多数来自美国和中国，印度分离株非常少；phylogroup2的三个主要STs，如ST357、ST1047和ST316，显示出对抗多种药物ARGs的MDR谱。在印度，phylogroup2的流行率和AMR丰度明显较高。A. baumannii可分为4个主要的国际克隆，最常见和最广泛的是IC-2（n = 12,33%）和IC-1（n = 7,19%），其次是IC-7和IC-8的4个分离株（图4B）。系统发育显示，所有这些研究分离株都与同一时期收集的其他印度分离株相邻。但ST164以及两个位置的STs形成了独特的分支。![]()
图3 A. E.coli（n = 995）和B.K. pneumoniae（n = 776）的全球系统地理学分析
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图4 A.P. aeruginosa（n = 323）和B.鲍曼假单胞菌（n = 582）的全球系统地理学分析
6、泛基因组分析揭示了基因流动对基因组组成差异的影响
作者分析了E. coli、K. pneumoniae、P. aeruginosa和A. baumannii的全基因组，以确定核心基因以及由于基因流动而可能获得或丢失的差异性附属基因。在使用Panaroo进行传统泛基因组分析（同源性阈值98%）的基础上，通过“twilight”应用程序按照附属基因的分布频率对这些基因做了进一步分类。在整体基因分类中，每种病原体都显示出与其基因组特征相关的独特谱系。与它们各自参考染色体CDS比较，E.coli（2784/4298-64.77%）和A.
baumannii（2311/3582-64.51%）的核心基因数量相对较少，而K. pneumoniae（4077/5316-76.6%）和P. aeruginosa（4598/5572-82.5%）较多。P. aeruginosa基因组大小（6.6 Mbp）和GC含量较高（66.6%），核心基因数量非常可观。但是其intermediate和rare基因的比例相当高。而lineage-specific
rare基因比例较高的则是E. coli、K. pneumoniae和P. aeruginosa。这些附属基因的显著差异表明这些病原体的遗传多样性。此外，这几种病原体都分别分成全球（除印度外的其他国家）、印度及本研究分离株3组进行分组研究。在所有病原体中，intermediate和rare基因的比例显著，且主要与假定基因和移动遗传元件（MGEs）相关联。这为我们进一步研究与ARGs相关的MGEs在本研究分离株中的作用提供了线索。![]()
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图S7-S10 E.coli、K.
pneumoniae、P. aeruginosa和A.
baumannii的泛基因组分析
7、AMR决定因素的传播性通常与特定的病原体MGEs有关
Plasmid-finder数据库显示，获得性质粒存在于（n=106/203）个本研究的分离株中，包括38种不同的类型。以下是携带质粒菌株的分布情况：E.coli（n = 35/35）、K.
pneumoniae（n =
47/49）、鼠伤寒沙门氏菌（n =
14/28）、霍氏肠杆菌（n = 4/5）、P.
aeruginosa（n =
4/40）和A. baumannii（n = 2/36）。平均而言，E.coli携带3.5个质粒；其次是K.
pneumoniae，3.2个质粒；然后是霍氏肠杆菌，1.75个质粒。非发酵菌在各个分类群中只有一种质粒类型。虽然大量的质粒被发现，但并不是所有的质粒都携带ARGs。相反，只有极少数分离株显示出获得性质粒与其ARGs有遗传联系。这可能与分离株基因组是草图有关，因为这些基因组不能完全覆盖以推断携带ARGs的MGEs相关性。基于MGE-finder，115/203个基因组显示出ARG与IS以及一些转座子存在连锁关系。A.
baumannii（89%）和P. aeruginosa（88%）携带的IS元件数量相比于E. coli（69%）和K. pneumoniae（49%）要丰富得多。这些MGE大多数具有种特异性，除了少数类型，如ISVsa3，仅在P. aeruginosa和A. baumannii中发现，并且与sul2、tetB、floR以及AMEs [aph(3'')-Ib、aph(6)- Id]相关。同样，IS6100和Tn5403在E. coli、K. pneumoniae和P. aeruginosa中常见，然而，两种MGE中存在的ARG类型是不同的。在转座子Tn6082上，E. coli和K. pneumoniae携带mphA和rmtB，而P. aeruginosa携带aph(6)- Id和aph(3’’)- Ib。A. baumannii携带特异性的ISAba24（IS66家族）。此外，armA与ISEc29（IS4家族）存在遗传连锁。尽管本研究分离的IS元件丰富多样，但物种特异性类型显示这些ARGs在不同MGE遗传背景下传播。除了关联分析之外，作者还进一步推导了质粒序列中抗性基因（ARGs）和插入序列/转座子（IS/Transposon）元素的遗传排列。为实现这一点，使用BLAST分析确定参考序列，并将覆盖这些区域的contigs映射到相应的参考序列上。blaNDM-5变体在E.coli中非常丰富，其相邻区域都存在bleMBL，无论谱系如何（图5B）。而blaNDM-1被发现于多种不同的病原体中，具有多样化的遗传背景（图5A），这与blaNDM-5变体不同。blaCMY-42存在于E.coli的IncI_Alpha质粒上，然而，其相邻的IS1家族转座酶可能由于序列覆盖度较低而被遗漏。![]()
图5 A.blaNDM-1和B.blaNDM-5的遗传背景比较
8、通过全细胞蛋白质组监测ARGs功能
为了更好地理解ARGs的功能，作者研究了在有或无不同抗生素的条件下，敏感型和MDR病原体的全细胞蛋白质组。使用SWATH-MS平台，在K. pneumoniae、A. baumannii、E. coli和P. aeruginosa中分别鉴别和定量了1840、1554、1472和824种蛋白质。主成分分析（PCA）获得了这些MDR病原菌不同分离株的蛋白质组，X轴和Y轴上对照和耐药分离株之间明显分离。层级聚类进一步证实了差异结果。蛋白质组分析有检测到大多数AMR蛋白质的表达，包括临床相关蛋白质，如16S
rRNA甲基转移酶、O-磷酸转移酶、N-乙酰转移酶、大环内酯磷酸转移酶、核苷酸转移酶、β-内酰胺酶、PBP1b、MFS和RND外排泵、磺胺耐药蛋白sul以及双功能多黏菌素耐药蛋白arnA。此外，也有许多其它的蛋白质表现出差异表达，它们主要与代谢、转录和翻译调节以及应激反应有关。这些发现表明，其他途径的改变可能直接或间接地与AMR相关，从而在适宜的环境条件下促进ARGs的功能和传播。![]()
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图S15-S20 LC-MS/MS分析比较对照、NA、Kan及Amp抗性分离株模式特征（A.差异蛋白数量；B.主成分分析；C.层级聚类）
文章结论
本文研究了印度不同地区分离的多重耐药革兰氏阴性菌及全球大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的耐药异质性。而这种异质性体现在以下几个方面：1、耐药基因异质性：
不同病原体携带的耐药基因具有明显的特征性（就是有些基因在某些物种中比较常见，有些在另外的物种中比较常见）；2、移动元件异质性：
ARGs通常与特定的移动元件（MGEs）相关联，比如质粒、插入序列和转座子，且同一种MGEs在不同物种中携带的ARGs可能不同；3、流行谱系异质性：
ARGs与特定的病原体谱系相关联（就是某些ST可能更容易获得或长期保持ARGs）；4、地理区域异质性：
病原体谱系在地理上具有差异性和特征性（就是某些ST和ARGs可能在某些地区很常见，但在其它地区却很少发现）。参考文献
Mehrotra T, Konar D, Pragasam A K, et al.
Antimicrobial resistance heterogeneity among multidrug-resistant Gram-negative
pathogens: Phenotypic, genotypic, and proteomic analysis [J]. Proceedings of
the National Academy of Sciences, 2023, 120(33): e2305465120.
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