Nature Microbiology:在鲍曼不动杆菌中,一个高频的表型转换将细菌毒性和环境适应性联系起来

学术   2024-12-17 08:48   上海  

文章题目:A high-frequency phenotypic switch links bacterial virulence and environmental survival in Acinetobacter baumannii

通讯作者:David S. Weiss & Philip N. Rather

作者单位:埃默里大学医学院,美国

期刊:Nature Microbiology Letters

影响因子:20.5

发表时间:2018年4月24日

DOI号10.1038/s41564-018-0151-5


摘要

抗生素耐药性感染每年在全球范围内导致70万人死亡。然而,克隆细菌中表现型多样的亚群在疾病进展中的作用尚不清楚。我们的研究发现,致病性日益增强且耐药性逐渐上升的病原体鲍曼不动杆菌中存在一种高度致病的亚群细胞,这些细胞是导致疾病的主要原因这种致病性亚群具有更厚的荚膜,并对宿主抗菌因子具有抗性,这种抗性在感染过程中使其数量逐渐增多。重要的是,从人类患者血液中分离得到的细菌全部属于该致病性亚群。此外,这种致病性形式表现出对医院消毒剂和干燥环境的更高耐受性,这表明其在环境中持久存在以及疾病传播中的重要作用。我们还发现了一种调控无致病性细胞与致病性细胞转化的转录“主调控因子”。过表达这种因子可消除细菌的致病性。此外,过表达的菌株能够保护小鼠免受致死性感染,起到“疫苗”的作用。这项研究揭示了一种能显著改变感染结果的细菌表现型亚群,同时说明了利用调控这些表现型转换的机制来减弱细菌毒力、开发干预措施的潜力。


正文

鲍曼不动杆菌已成为全球范围内的主要医疗威胁,它既能引起医院感染,也能导致社区感染。这些感染的毒性日益增强,并且由于细菌的高度抗生素耐药性而极其难以治疗。在美国,63%的分离菌株对多种抗生素具有耐药性,甚至一些菌株对所有抗生素都表现出耐药性(全耐药性)。此外,鲍曼不动杆菌在医院环境中难以根除,其污染重症监护病房(ICU)的情况十分常见。这种细菌在医院环境中顽强生存的能力,归因于以下两个方面:①对常用消毒剂的固有抗性;②在干燥环境中长期存活的能力。尽管其毒力、对消毒剂的抗性以及对干燥的耐受性对其持久存在和传播起到了关键作用,但控制这些特性的分子机制仍不清楚。这使得鲍曼不动杆菌的防控和治疗成为医学领域的重大挑战。

细菌可以表现出基因型异质性或表型异质性。表型异质性是指在遗传上同质的细菌群体中,一些细胞表现出不同的性状特征。对高度致病的鲍曼不动杆菌分离株AB5075的研究表明,该菌株表现出表型异质性,能够在形成不透明菌落(opaque)或半透明菌落(translucent)的细胞之间快速转换。单个菌落可以依次在不透明状态和半透明状态之间传播,并显示出一定的转换频率:在培养24小时的菌落中为~4–13%,在培养48小时的菌落中则为20–40%。



我们假设,荚膜的差异可能导致致病性不透明细胞(VIR-O)和非致病性半透明细胞(AV-T)之间的不透明性差异。通过用红钌染色后进行电子显微镜观察发现,VIR-O细胞产生的荚膜比AV-T细胞厚约两倍。相比之下,缺乏荚膜合成所需的Wzc酪氨酸激酶(Δwzc)的VIR-O和AV-T细胞无法产生任何荚膜物质,表现出比AV-T细胞更明显的半透明表型。这表明,荚膜在VIR-O细胞的致病性和表型差异中起着关键作用。

这些两种表型亚群在疾病进展中的作用尚不清楚。在用两种细胞类型以1:1比例对小鼠进行鼻内接种后,24小时感染后,在所有检测的器官中(即肺、脾和肝),VIR-O细胞明显优于AV-T细胞。同样的结果也出现在单一感染实验中,感染VIR-O细胞的小鼠肺部的细菌数量比感染AV-T细胞的小鼠高出超过10,000倍。此外,在感染VIR-O的小鼠中,脾脏和肝脏中的细菌数量比感染AV-T的小鼠高出1,000倍。令人惊讶的是,从感染VIR-O的小鼠中分离的细菌仍然保持VIR-O形式,而从感染AV-T的小鼠中分离出的VIR-O细胞频率却比接种液中增加了3,000多倍(AV-T接种液中含有0.01%的VIR-O细胞)。

此外,从AV-T菌落中分离出的VIR-O细胞在小鼠体内重新获得了毒力,确认了AV-T细胞的减毒特性并非由于基因组中的随机突变。这些结果表明,体内对VIR-O群体存在强烈的选择压力。在存活实验中,感染VIR-O的小鼠在第2天迅速死亡,而感染AV-T的小鼠则存活下来。VIR-O和AV-T变体在丰富培养基和定义培养基中的生长速率相似,表明AV-T变体的毒力缺陷与内在生长速率的差异无关。综上所述,这些数据表明,VIR-O群体具有毒性,并在体内感染过程中占主导地位,而AV-T群体则无法引起急性疾病。

尚不清楚哪些因素导致了VIR-O群体在体内肺部感染后显著富集。肺部富含固有免疫抗菌物质,包括溶菌酶、抗菌肽(如与猫源抗菌肽相关的抗菌肽,CRAMP)和活性氧类。我们假设VIR-O细胞相比AV-T细胞对这些抗菌物质更具抗性。为了验证这一点,我们使用过氧化氢(可产生活性氧类)、溶菌酶和CRAMP进行杀菌实验。在用三种抗菌物质分别处理1小时后,VIR-O细胞的数量显著超过AV-T细胞。此外,在用LL-37(CRAMP的人类同源物)处理后,VIR-O细胞数量同样超过了AV-T细胞。这些数据表明,VIR-O细胞比AV-T细胞对多种固有免疫抗菌物质具有更高的抗性。为了验证这些宿主防御机制是否促进了体内感染过程中VIR-O亚群的富集,研究人员用AV-T细胞接种了野生型(WT)小鼠和三重敲除(TKO)小鼠。TKO小鼠缺乏功能性的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(cybb–/–,该酶负责产生活性氧类)、CRAMP(cramp–/–)和溶菌酶(lysM–/–)。感染8小时后,与TKO小鼠相比,WT小鼠肺部中的VIR-O细胞比例更高。尽管如此,TKO小鼠的总体细菌水平仍高于WT小鼠。这些数据表明,在早期感染阶段,活性氧类、CRAMP和溶菌酶对毒性较强的VIR-O亚群的富集有特定贡献。然而,由于在TKO小鼠中VIR-O群体仍然出现富集,这表明还有其他宿主因素参与其中。

由于VIR-O亚群表现出对宿主来源抗菌物质的增强抗性,我们假设这些细胞可能对医院消毒剂也具有抗性。我们测试了VIR-O和AV-T亚群对三种最常用消毒剂——苯扎氯铵(BZT)、苯扎氯(BAK)和氯己定葡萄糖酸盐(CHG)的敏感性。

结果显示,与AV-T细胞相比,VIR-O细胞对这三种消毒剂均表现出更强的抗性。除了对消毒剂的抗性外,抗干燥性也是鲍曼不动杆菌在医院环境中持续存在的一个重要因素。在干燥处理8天后,VIR-O细胞在干燥表面上的生存能力比AV-T细胞更强。此外,尽管从VIR-O细胞中回收的可活细菌仍保持VIR-O形态,但从干燥处理过的AV-T细胞中回收的VIR-O细胞频率却增加了超过5,000倍。综上所述,这些数据将增强的毒力和环境持久性(对医院消毒剂和干燥的抗性)与单一的表型亚群细菌细胞联系了起来。

为了阐明控制VIR-O和AV-T亚群的因素,我们使用RNA-Seq进行了全基因组转录组分析。结果显示,一个预测的TetR型转录调控因子ABUW_1645是在VIR-O和AV-T亚群之间差异表达最显著的调控基因之一。PCR验证了AV-T群体中ABUW_1645的表达水平比VIR-O细胞高60倍。有趣的是,随着AV-T细胞逐渐转变为VIR-O,ABUW_1645的表达显著降低,而在VIR-O细胞中,其表达水平维持在较低水平。对ABUW_1645进行框内缺失突变后,未改变VIR-O到AV-T的转变速率,但AV-T到VIR-O的转变速率相较于野生型小鼠提高了18倍,表明ABUW_1645在维持AV-T状态中起着重要作用。

令人惊讶的是,在VIR-O细胞中过表达ABUW_1645(VIRO/1645)导致了半透明的菌落形态,并完全无法转回VIR-O。同样,在AV-T细胞中过表达ABUW_1645(AV-T/1645)也表现为‘锁定’状态,无法转变为VIR-O细胞。对VIR-O/载体和VIR-O/1645细胞的转录组分析显示,ABUW_1645调控了约70%在VIR-O和AV-T细胞中差异表达的基因。

综上所述,这些数据将ABUW_1645确认为VIR-O/AV-T高频表型转变的关键调控因子。此前已知的突变(ompR基因突变导致VIR-O到AV-T转变速率增加;arpB基因突变导致VIR-O到AV-T转变速率减少)并未改变ABUW_1645的表达。此外,ABUW_1645的缺失也未改变ompR::Tc突变体的超频转变表型。另外,RNA-Seq数据表明,ABUW_1645过表达并未改变ompR或arpB的表达。因此,ABUW_1645通过与OmpR或ArpB调控路径不同的途径来调控表型转变。

在VIR-O细胞中过表达ABUW_1645完全逆转了对宿主抗菌物质、消毒剂和干燥的抗性。在单一感染实验中,无论是VIR-O/vector还是AV-T/vector细胞感染的小鼠中均可回收VIR-O细胞(c)。相比之下,仅在感染了ABUW_1645过表达菌株的小鼠中回收到了AV-T细胞(c)。这一现象与VIR-O/1645和AV-T/1645菌株的显著减毒相关,这两种菌株在小鼠肺部的细菌水平较VIR-O/vector感染小鼠减少了7个对数单位(d)。此外,由于ABUW_1645过表达菌株的毒力甚至低于AV-T细胞,这些数据表明,AV-T感染过程中小鼠中残留的定植细菌实际上是VIR-O细胞,它们在感染过程中逐渐富集。这强烈表明,AV-T细胞在体内感染过程中无法复制和/或生存,而VIR-O细胞则负责引发疾病。与这些发现一致,感染ABUW_1645缺失突变体的小鼠中回收到了VIR-O细胞。与野生型小鼠相比,这一菌株并未出现减毒现象,但ABUW_1645过表达菌株则表现为减毒。VIR-O/1645细菌未能引起致命感染,而VIR-O/vector细胞则迅速引发致命感染(e)。这些数据突出了ABUW_1645作为毒力和与医院环境持久性相关特征的关键调控因子的作用。由于VIR-O/1645菌株在体内完全减毒,我们进一步测试了它是否能保护小鼠免受后续的致命VIR-O/vector感染。尽管对照组小鼠在接受了磷酸盐缓冲液(PBS)或大肠杆菌K-12的接种后,在第2天迅速死亡,但接种VIR-O/1645的鼠群则完全得到保护(f)。这些数据表明,一种经过工程改造、仅产生非致病性细胞的菌株能够有效提供对原本致命感染的保护,作为一种活减毒疫苗对抗鲍曼不动杆菌。

由于VIR-O细胞在小鼠体内实验感染中明显占主导地位,并且在模拟医院环境中遭遇的压力条件下也表现出显著优势,我们进一步测试了它们在人类住院患者样本中的丰度。来自五名系统性鲍曼不动杆菌感染患者的血液培养物直接接种在琼脂平板上,结果仅从这些临床分离株中检测到了VIR-O细胞(g)。因此,与小鼠实验感染类似,VIR-O细胞在人类感染中也占主导地位。此外,AV-T变体可以从每个临床分离株的VIR-O细胞中筛选出来,表明这种表型转变在AB5075以外的鲍曼不动杆菌分离株中也存在。此外,每个分离株中的AV-T亚群相对于对应的VIR-O亚群,ABUW_1645的表达显著更高,这进一步支持了该调控因子在VIR-O到AV-T转变中的关键作用(h)。这些结果提供了来自不同分离株的临床证据,突显了VIR-O细胞表型亚群在人体疾病中的关键作用。

一个剩下的问题是:AV-T亚群对鲍曼不动杆菌有哪些优势?在AV-T细胞中上调的一部分基因被预测参与芳香化合物的分解代谢(ABUW_0066、ABUW_0068和ABUW_0070)、从有机来源生成游离磷酸盐和硫(ABUW_0904和ABUW_2921)、铁储存(ABUW_3125)以及营养物质的运输(ABUW_0143、ABUW_3403和ABUW_1660)。这引出了一个可能性,即AV-T亚群更适合在宿主外的自然环境中生存,在这些环境中营养物质有限,细菌可能依赖于吸收和分解非常规化合物作为营养源。事实上,相较于VIR-O细胞,AV-T细胞在贫营养培养基(Chamberlain培养基)中能够生长得更好。生物被膜形成可能有助于细菌在自然环境中的定植,例如土壤和水中,AV-T细胞在低温(25°C)下比VIR-O细胞更擅长形成生物被膜。此外,在宿主外的低温条件下,AV-T细胞中的ABUW_1645表达增加,而在37°C的培养温度下则下降(图4c)。相应地,当AV-T细胞在宿主温度(37°C)下生长时,转变为VIR-O细胞的速率增加了超过3,400倍。这些数据与小鼠感染实验和人类样本中的结果一致,其中VIR-O细胞明显占主导地位,数量远远超过AV-T细胞。综上所述,这些结果表明,AV-T细胞更适合在某些环境条件下生存,它们较低的荚膜水平甚至可能使这些细胞对噬菌体具有抗性。


总结

本研究揭示了一种表型转变,连接了宿主抗菌物质的抗性、毒力和环境持久性。数据突出了特定宿主先天免疫抗菌物质(如CRAMP、溶菌酶和H2O2)在小鼠感染过程中促进毒性VIR-O亚群富集的意外作用。我们的数据清楚地表明,VIR-O细胞是体内引发疾病的主要细胞。除了是从感染小鼠中回收的主要细胞外,只有VIR-O细胞在感染人类患者的血液中被发现,进一步凸显了它们在毒力中的关键作用。因此,很可能感染患者排放到环境中的细菌细胞是VIR-O形态。值得注意的是,VIR-O细胞在抗消毒剂和抗干燥性方面也表现出更强的能力,这两种压力正是医院环境中常见的应激因素。这表明,令人担忧的是,人类感染选择了那些最适合在环境中持久生存的细胞,而环境中持久存在的细菌细胞恰恰是那些在传播给未来人类宿主时具有最强毒力的细胞。因此,VIR-O亚群可能是医院病房内存在的一种令人担忧的循环的基础,这也解释了为何鲍曼不动杆菌难以根除,并且许多感染具有高毒性。控制毒力的表型转变在细菌和真菌病原体中都有发现,这也可能代表一种风险对冲策略,其中非致病性亚群在宿主外具有选择性优势。有趣的是,Photorhabdus luminescens中的表型转变与鲍曼不动杆菌有相似之处,其中毒性亚群对宿主抗菌物质具有更强的抗性。此外,在真核生物Candida albicans中,控制白色-不透明菌落转变的表型转变也与鲍曼不动杆菌系统存在相似之处,包括毒力、细胞形态和生物被膜形成方面的亚群差异。ABUW_1645的过表达完全将VIR-O细胞转化为AV-T细胞,并逆转了VIR-O细胞的毒力和环境持久性特性。因此,虽然VIR-O/AV-T表型转变对于促进鲍曼不动杆菌的毒力至关重要,但我们的数据表明,它可以被颠覆并转变为“阿基里斯之踵”。驱动细胞进入AV-T形态的小分子将使细胞失去毒性,并可能代表一种治疗感染的潜在治疗策略。此外,我们还证明,高度减毒的ABUW_1645过表达菌株是一个有前景的活减毒疫苗候选株,能够在致命挑战中提供显著的保护。这些发现突显了如何利用对细胞亚群所赋予的表型特征的知识来推动转化性干预。

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