文献解读 | 肺炎克雷伯菌新型anti-CRSIPR蛋白AcrIE10的发现

为鉴定新的Acrs，研究者挑选了四个具有代表性的临床MDR或virulent菌株（Kp8、Kp7450、Kp1231、KpX2）进行研究。它们的特点在于：① 基因组编码I-E型或I-E*型 CRISPR-cas系统（CRISPRCasFinder，图1A）；② 前噬菌体和质粒含有self-target序列与CRISPR array间隔区相匹配（CRISPRTarget，图1B）。通过蛋白预测及BLASTp比对，研究者最终在4个代表菌株中获得了692个与MGEs（指前噬菌体和质粒）相关的假定蛋白。

为确定这些假定蛋白是否属于Acr蛋白，研究者构建了一个包含这692个假定蛋白的酵母双杂交（YTH）文库，并分别使用I-E/E* CRISPR-Cas系统的Cas/Cas*亚基作为诱饵，检测假定蛋白与其相互作用的潜力（图1C）。筛选结果显示Kp8质粒的Orf26750蛋白可以与I-E CRISPR-Cas系统的Cas5亚基相互作用，Kp7450质粒的Orf26620和Orf27615蛋白分别可以与I-E* CRISPR-Cas系统的Cas6*和Cas7*亚基相互作用（表1）。且这3种蛋白均与已报道的Acrs序列无相似性。（酵母双杂交）

为验证这3个蛋白是否为Acr，研究者首先通过实验检测了它们对I-E/E* CRISPR-Cas系统DNA切割活性的抑制效果。该实验在缺乏内源性CRISPR-Cas系统和CRISPR-Cas抑制基因hns的改良大肠杆菌JS682中分别构建肺炎克雷伯菌的I-E和I-E*型 CRISPR-Cas系统，以获得大肠杆菌JS683Δhns和大肠杆菌JS684Δhns。CRISPR-Cas系统的DNA切割活性通过靶质粒的转化效率来衡量。如图2A所示，仅Orf27615 | target组的转化效率恢复到与对照组相当的水平，而其它两种蛋白并没有显示任何的质粒保护作用，这表明只有Orf27615属于新的Acr，该蛋白最终被命名为AcrIE10。（质粒靶向实验）

接下来，研究者继续测试了AcrIE10对I-E* CRISPR-Cas系统噬菌体感染防御功能的抑制效果。CRISPR靶向噬菌体EC1的感染效率通过细菌平板上噬菌斑的结果来进行评估。结果显示AcrIE10的存在几乎完全抑制了肺炎克雷伯菌I-E* CRISPR-Cas系统的活性，恢复了噬菌体EC1的感染能力。（噬菌体靶向实验）

总之，这些结果证实了AcrIE10可以抑制I-E* CRISPR-Cas系统对质粒和噬菌体的防御活性。

为探索AcrIE10是否能与Cas7*以外的其他Cas亚基发生相互作用，研究者通过YTH试验重新进行了评估。结果如图2C所示，Cas7*亚基是AcrIE10的唯一靶标。

之后研究者又进一步验证了AcrIE10和Cas7*之间的相互作用。Pull-down实验显示无论6×His亲和标签的蛋白位置如何，AcrIE10和Cas7*都会被Ni-NTA珠共洗脱（图2D）。且体积排除色谱得到了稳定的AcrIE10和Cas7*复合物，化学计量比为1:1（图2E）。

这些结果说明AcrIE10可与Cas7*亚基形成稳定复合物。

为深入了解AcrIE10 anti-CRISPR功能的潜在机制，研究者以2.5 Å分辨率测定了AcrIE10-cas7*复合物的晶体结构。从三维结构上看，AcrIE10形成了同源二聚体，每个AcrIE10原聚体与一个Cas7*分子相互作用，整个复合物就像一只蝴蝶，其主体是AcrIE10同源二聚体，翅膀是两个Cas7*分子（图3A）。KpCas7*的整体结构与EcCas7类似，由palm、finger、thumb和crRNA-binding groove组成（图3B）。两个AcrIE10原聚体通过由α1、α2和N端环组成的hook domain相互连接（图3C）。AcrIE10的C末端螺旋束（α3-6）占据Cas7*的crRNA groove，其相互作用由广泛的氢键网络稳定，可能涉及如图3D所示的AcrIE10和Cas7* interface残基。（晶体衍射和3D模型构建）

为研究这些interface残基对AcrIE10-Cas7 *相互作用的贡献，研究者构建了每个残基的丙氨酸（或色氨酸）替代模型，并通过YTH实验测定了突变体的相互作用。结果发现，Cas7*的R43、S46和Q280残基以及AcrIE10的E78残基对于两者的相互作用至关重要（图3E、F）。且hook domain的缺失也会使AcrIE10与Cas7*之间的相互作用失效（图3F）。另外，噬菌斑实验显示，E78丙氨酸取代显著削弱了AcrIE10的抗CRISPR功能（图3G）。

综上所述，维持AcrIE10的二聚体状态对于它和Cas7*之间的相互作用非常重要。关键的AcrIE10-Cas7* interface残基突变会严重破坏AcrIE10与Cas7*的相互作用，并削弱其anti-CRISPR功能。

AcrIE10-cas7*晶体结构与先前报道的大肠杆菌K12监视复合体的晶体结构之间的结构叠加表明，AcrIE10可能干扰监视复合体的组装。大肠杆菌K12 I-E型CRISPR-Cas的监视复合体由11个亚基组成，其中6个Cas7亚基形成六聚体并作为监视复合体的骨架。有趣的是，AcrIE10的α3-7会占据Cas7*本应结合的位置，AcrIE10-Cas7*连接和Cas7*-Cas7*连接近乎完全重叠表明，AcrIE10可能干扰Cas7*监视复合体骨架的组装（图4A和B）。为验证这一点，研究者在大肠杆菌JS684变异菌株中进行了StrepII-Cas7*和Flag-Cas11*的免疫共沉淀实验（co-IP），实验发现AcrIE10的表达显著抑制了Cas7*和Cas11*之间的相互作用，该结果支持AcrIE10直接与Cas7*结合，阻止Cas7*六聚化及破坏监视复合体组装的观点（图4C）。

此外，由于crRNA穿过Cas7*亚基的groove domains，而AcrIE10-Cas7*复合物的结构表明，AcrIE10的α3、α6和α8位于crRNA占据的相同位置，这样的空间冲突意味着AcrIE10可能会阻止Cas7*装载crRNA从而干扰监视复合体的组装。与该假设一致，Northern blot结果显示，AcrIE10的存在降低了E. coli JS684Δhns内部的crRNA水平（图4D），这可能是由于AcrIE10存在时crRNA的保护作用减弱所致。

各种细菌的I-E型监测复合物的报道结构表明，复合物组装和crRNA负载具有保守的机制。Cas7与它的同源蛋白在长度上比较接近（343-402个氨基酸），但不同蛋白间的序列差异却很大（31-78%）（图4E）。序列比对显示，与AcrIE10接触的Cas7*残基在5个细菌门的各种Cas7同源蛋白中表现出高度的保守性，这可能是因为它们也是组装监视复合物和装载crRNA的关键残基（图4E）。

序列的保守性提高了这些细菌物种AcrIE10与Cas7相互作用的可能性。为了验证这一假设，研究者利用YTH实验探索了来自代表性细菌物种的AcrIE10和Cas7的相互作用。结果表明，AcrIE10可以与大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌等病原菌的所有Cas7相互作用（图4F）。为证实这种相互作用，研究者在大肠杆菌细胞中用6×His标记的AcrIE10或6×His标记的GST共表达上述每种Cas7蛋白，并探索6×His标记的AcrIE10是否可以pull-down Cas7蛋白。结果显示，在Ni-NTA亲和纯化步骤中，所有Cas7蛋白都被AcrIE10pull-down，而不是GST（图4G）。为进一步验证AcrIE10的广泛抑制活性，研究者在含有天然I-E型CRISPR-Cas系统的大肠杆菌BW25113Δhns细胞中检测了其anti-CRISPR功能。结果表明，AcrIE10显著提高了CRISPR靶向质粒的转化效率，进一步证实了AcrIE10在天然条件下具有广泛的anti-CRISPR功能（图4H）。

总之，AcrIE10结合到Cas7的保守表面，可能对大多数I-E型CRISPR-Cas系统表现出广泛的抑制活性。

为探索新鉴定的AcrIE10蛋白的分布情况，研究者在UniProt数据库中进行了BLAST比对，以检索AcrIE10-like蛋白，结果显示157个条目具有明显的序列相似性（identities > 25%）。通过AlphaFoldDB预测，研究者发现在157个同源蛋白中有131个蛋白的折叠结构与AcrIE10相似。而这131个条目又来源于3个噬菌体和128个细菌的基因组，且根据种属关系，这128个细菌包含在Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria或Firmicute的36个不同细菌物种中（图5A）。此外，128个条目里，有79个条目显示蛋白在质粒中，11个条目由前噬菌体编码，另外38个条目出现在其他区域。有趣的是，11个前噬菌体和3个裂解噬菌体在其基因组中编码AcrIE10，这意味着噬菌体可能也利用AcrIE10来抑制宿主的适应性免疫系统。值得注意的是，编码AcrIE10的细菌中有一半以上属于γ-变形菌，其中许多临床病原体拥有I-E型CRISPR-Cas系统。（系统发育分析）

简而言之，我们发现AcrIE10在细菌和噬菌体的基因组中广泛编码，特别是在MGEs中。

为探究自然界中AcrIE10的存在是否与肺炎克雷伯菌接合质粒的转移有关，研究者使用BLASTp对从公开获取的肠杆菌科数据库中下载的质粒（共2423个）进行了AcrIE10蛋白检索（coverage>80 % and identity>80%）（图5B）。结果在446个质粒中鉴定出了446个同源蛋白，其中432个分布在肺炎克雷伯菌中。含有接合转移模块的有415个，402个分布在肺炎克雷伯菌中。且在402个接合质粒中，28个质粒编码毒力相关基因（mrk、ybt、iut等），289个质粒编码耐药相关基因（blaTEM、blaKPC、sul2等），7个质粒同时编码毒力和耐药基因。这一现象说明AcrIE10可能在接合质粒传播中发挥着潜在的作用，对耐药和毒力基因的传播有重要贡献。

为进一步证明AcrIE10提高了接合质粒的转移效率，研究者比较了在含或不含AcrIE10的情况下，CRISPR靶向的接合质粒转移到携带I-E/E*型 CRISPR-Cas系统的受体细菌上时的接合转移效率。结果表明，无论是由质粒携带（图6A和B）还是在受体细胞中预表达（图6D和E），AcrIE10都提高了CRISPR靶向质粒的接合效率。（接合转移实验）

为研究AcrIE10对于维持细菌细胞中CRISPR靶向接合质粒稳定性方面的作用，研究者从大肠杆菌JS683Δhns/JS684Δhns中敲除了介导I-E/E*CRISPR-Cas系统间隔区获取的基因cas1和cas2，并比较了CRISPR靶向结合质粒在有或没有AcrIE10的大肠杆菌中的稳定性。结果发现，有AcriE10s的接合质粒在传代细胞中保持稳定，而没有AcriIE10的结合质粒则在传代过程中迅速丢失（图6C和F）。（质粒稳定性实验）

这些结果反映了AcrIE10在提高质粒接合转移效率和保持CRISPR靶向接合质粒跨代稳定性方面的重要意义。