文章题目：Structural basis for Acinetobacter baumannii biofilm formation
通讯作者：Anton V Zavialov
作者单位：图尔库大学化学系
期刊：PNAS
影响因子：9.4
发表时间：2018年5月
DOI号：10.1073/pnas.1800961115
院内感染和留置器械感染是全球主要的医疗保健问题。这些感染与病原体在生物和非生物表面上形成生物被膜的能力密切相关。多重抗生素耐药鲍曼不动杆菌是最麻烦的病原体之一，能够通过Csu菌毛定植于医疗设备中，Csu菌毛是一种粘性细胞器，属于普遍存在的古老伴侣-引导菌毛。在这里，我们从原子分辨率尺度上报告了细菌附着在非生物表面的机制。我们表明，古老的菌毛使用一种结合机制，使细菌能够粘附到结构可变的底物上。提出了一种简单而廉价的解决方案，可以减少鲍曼不动杆菌和相关病原体的感染。
为了建立一个方便的模型来研究Csu菌毛的功能，在大肠杆菌中克隆了Csu基因簇。菌毛的表达导致重组菌株对疏水性塑料，特别是聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯具有很强的粘附性。这些材料被广泛应用于医疗设备中。
与鲍曼不动杆菌19606菌株一样，重组大肠杆菌生物膜在液-气界面特别明显，并且在用结晶紫染色细胞后，可观察到与黄色荧光蛋白(YFP)共表达Csu菌毛的细菌荧光环或蓝色环。还观察到菌株对亲水性表面的粘附，如玻璃和玻璃纸。然而，这些生物被膜很容易被冲洗掉，这表明Csu菌毛仅介导细菌对疏水性底物的紧密粘附。
透射电子显微镜观察发现，与经典的1型菌毛和Pili相比，诱导菌株的菌毛更为细长。CsuA/B和CsuE的缺失使菌毛组装完全消失。CsuA和CsuB的删除导致少量菌毛组装异常。然而，所有的缺失突变体都不能在塑料上形成生物膜，这表明所有的四个亚基都是形成功能性菌毛所必需的。
虽然CsuA/B、CsuA和CsuB可能作为菌毛柄的结构单元，但Csu E对于组装的起始必须是关键的，类似于尖端定位的1型TDAs和P菌毛。为了深入了解CsuE的作用，我们测定了CsuE与CsuC伴侣复合物的X射线晶体结构。
利用硒代蛋氨酸单反常色散(Se-SAD)相位解析CsuC-CsuE复合物的结构，分辨率为2.3 Å 。P1单位细胞中存在2个拷贝的CsuC-CsuE异源二聚体。CsuC的结构在两个拷贝中几乎相同，Cα原子之间的RMSD偏差为0.5 Å，与CsuC-CsuA/B复合物中CsuC的结构相似。对CsuE分子进行比较，发现( RMSD为1.4)差异较大。Csu E折叠成2个β桶状结构域。结构域之间的夹角使分子整体呈类C形状，弯曲于Csu C的结构域1。
CsuE的C端结构域结合在CsuC结构域之间的裂隙中。它有一个不完整的Ig样折叠，缺少典型的C末端G链。缺失的链由CsuC提供，CsuC将其链G1插入β -折叠DCC′D′边缘的疏水性groove中。由于groove在菌毛组装过程中很可能接受一条供体链将CsuE连接到纤维的其余部分，因此我们将该结构域称为菌毛结构域(CsuEpd )。事实上，作为目前古老的CU途径中的柄菌原型CsuA/B，CsuEpd与CsuA/B具有显著的结构相似性。与Csu C结合的Csu A/B一样，CsuEpd也有很大一部分无序或无序的序列，这进一步支持了我们之前的结论，即非经典分子伴侣与经典分子伴侣不同，保持亚基处于基本无序的构象状态。
N端结构域通过中间的一个带有脯氨酸的三残基连接子与CsuEpd连接。疏水相互作用以及氢键和离子键网络主导了结构域之间的界面。CsuE N端结构域(CsuENTD )具有α/β混合型结构。结构域的核心是由Ig类似物三明治结构形成的，由于β-折叠之间的边缘链A和D的开关而形成β-桶状结构。A1′链与G12链的结合导致了第二个β -折叠的平行-反平行混合结构，这也是经典体系和替代体系中TDAs凝集素结构域的共同特征。事实上，CsuENTD与CfaE和FimH的凝集素结构域具有相当的结构相似性，再次表明CsuENTD在细菌粘附中的可能作用。同时，比较这些结构发现了一个主要的拓扑差异。CsuENTD中，由于所有主要β-折叠中的loop插入，两个β -折叠都被分裂。因此，该结构不是由1个β桶状组成，而是由2个β桶状组成，每个β桶状由一个α-螺旋部分密封。这种独特的排列方式使得CsuENTD比其他已知结构的TDAs更长。通过在CsuENTD的尖端存在三个大的环形成三指结构，进一步增加了其长度。值得注意的是，指环具有很强的疏水性，疏水基序由24个表面暴露的残基组成，其中只有一个具有极性侧链。前两个疏水指环在古菌TDAs中是保守的，而第三个疏水环是鲍曼不动杆菌Csu菌毛所特有的。
指环的疏水性质促使我们研究它们可能参与了鲍曼不动杆菌在疏水底物上生物被膜的形成。我们引入了4个降低手指疏水性的突变。将残基L40ALA43替换为SGSG或SG，残基I140VGIGV145替换为SSGSGS，残基L157GI159替换为SGS分别破坏疏水指1-3。与缺失整个CsuE亚基相反，这些突变并没有降低Csu菌毛的组装水平，也没有影响它们的形态。然而，手指3的突变显著减少，手指1和手指2的突变实际上消除了生物被膜的形成。这些结果为三指结构提供了确凿的证据。
为了研究指环在疏水塑料结合中的作用，我们检测了突变I140VGIGV145→SSGSGS对CsuE与CsuC、CsuENTD与聚苯乙烯表面结合的影响。以实现蛋白结合的定量分析塑料、野生型和突变型CsuC-CsuE和CsuENTD用Eu3+标记。等量等量标记的野生型和突变型蛋白在聚苯乙烯板中孵育。尽管在我们的实验装置中，野生型和突变体蛋白都能与聚苯乙烯板结合，但对样品中Eu荧光的测量表明，野生型蛋白与塑料的结合效率始终高于相应的突变体。这一结果有力地说明了疏水指直接介导了Csu菌毛与疏水塑料的结合。
为了进一步研究Csu菌毛介导的生物被膜形成，我们制备了针对自身互补的CsuA/B亚基( αA/B )和CsuENTD (αEN)的多克隆抗体，并检测了这些抗体对鲍曼不动杆菌和表达Csu菌毛的大肠杆菌生物被膜形成的影响。用不同稀释度的αA/B和αEN抗体与免疫前血清(阴性对照)孵育细菌培养物，然后在聚苯乙烯微孔板孔中检测生物被膜的形成，稀释数千倍的αEN完全阻断鲍曼不动杆菌生物被膜的形成，αA/B也抑制生物被膜的形成，但仅在高浓度时观察到抑制。这一结果进一步强调了CsuENTD在细菌粘附hydr中的关键作用。
