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前言：之前的一篇写了NK细胞结合器（NK Cell Engagers，NKCE）激活靶点的选择。靶点决定了NK细胞活化的强度、持久性及被激活的NK细胞亚群。（感兴趣的读者可以查看《下一代杀手锏，NK细胞结合器！》）但NKCE在临床的最终目标是具有功能强效和生产使用方便，这两个方面都受到NKCE药物分子结构的影响。以下，我们讨论在药物设计的角度，影响NKCE功能和生产的几个关键考量。NK和肿瘤细胞间形成免疫突触（Immune synapse，IS）是NK清除肿瘤细胞的前提。NKCE进入体内后，可以接NK和靶细胞，促进IS的形成，随后通过受体结合，触发发NK细胞的激活，最终裂解肿瘤细胞。![]()
突触间隙具有一定的空间限制，大多数生理性IS的突触距离约为10-30 nm。超过此大小的分子从无法进入突触间隙，那就更谈不上诱导IS的形成。因此，NKCE的大小对于稳定IS形成至关重要。例如，与CD19比，CD20在细胞表面突出程度较低，在构建靶向CD19和CD20的NKCE时可能需不同设计，即使两种抗原均在相同B细胞上表达并均募集NK细胞。单克隆抗体的直径约为10nm，非常适合IS的大小。然而，在NKCE设计中会添加多个功能片段，从而实现多特异性或多价，这不可避免地会增加药物分子的大小，因此在设计中需要综合考量分子大小的限制。此外，在IS的形成的早期阶段，NK受体的高效聚集对于IS形成和NK活化至关重要。在设计上，增强抗体的化合价可以通过增加亲和力来潜在地改善靶标结合。肿瘤细胞表面抗原的下调是免疫逃逸的机制，如MM细胞中BCMA的下调。脱落的BCMA成为可溶性抗原，甚至能与膜结合的BCMA竞争结合NKCE并降低其功效。目前，NKCE的分子设计通常参考T细胞接合器（TCE），毕竟二者的底层逻辑一致，而且TCE在临床的使用更加成熟。据分子结构，NKCE大致可分片段化和IgG型两大类。由于片段结构没有Fc，通常比IgG形式更小。大多片段结构基于IgG的重链（H）和轻链（L）可变（V）区设计，并且通常不涉及抗体的恒定区。不同V区之间通过Linker链接（通常是VH和VL）形成scFv，并构建NKCE。![]()
在片段分子设计中，如何保证片段NKCE分子正确的包装和折叠尤为重要。这中间，两个V区间的Linker决定配对的成功与否。少于10个氨基酸的Linker通常不允许V区旋转和折叠，导致链间配对。研究表明，scFv的Linker应至少3.5nm，才能允许两个V区正确组装成scFv。典型的Linker是柔性和亲水的，可最大限度减少胞内蛋白折叠过程中的结构干扰。在实践中，药物设计有几种Linker比较常用，如（G4S/G3S）n、218s或HMA。![]()
其中（G4S）n最常用，因为它具有高柔韧性、低免疫原性以及丝氨酸残基可以增强溶解度的特点。此外，218s的蛋白水解稳定性更高，聚集减少，而HMA则表现出较低免疫原性。除了Linker外，次级键（如，二硫键）对成功组装片段型NKCE也至关重要。在三体形式中，重链和轻链之间的二硫键促进了配对。此外，在结构域间引入二硫键有助于工程化IgG的结构稳定。改造的IgG形式NKCE保留了Fc区，因此分在大小比片段形式要大。此类NKCE的典型工程方法包括改变IgG骨架的一个臂的特异性，或将抗原识别部分（scFv 或 Fab）添加到基础IgG的N端或C端。根据修饰的位置，改造的IgG，可进一步细分为不对称和对称类型。不对称IgG形式的NKCE在蛋白质折叠中面对更多挑战。主要是生产过程中的同源二聚化及轻重链错配。目前，已有多种技术来克服这些问题。对称的IgG形式可轻松规避不对称IgG固有的链配对问题，从而可能降低生产成本。然而，对称IgG如果想实现多特异性时，它们的大小要比不对称形式大得多。还有，抗原识别部分（Fab 或者scFv）的选择也会显著影响NKCEs的功能。尽管Fab在轻重链正确配对方面存在挑战，但它在功能上比scFv更有效。![]()
纳米抗体，也称VHH，是NKCE构建中非常好用的一个结构模块。与scFv/Fab不同，纳米抗体仅使用重链即可实现特异性抗原结合。因此，纳米抗体可规避配对和折叠问题，使其成为NKCE设计的重要选择。最近出现了一种称为Affibody的新型抗原识别分子其结构是大小约为7 kDa的三螺旋亚结构，这也是NKCE设计中的备选结构选择。![]()
除了分子机构设计对NKCE功能有直接影响外，在NKCE开发中还应考虑其他因素，如组织浸润、持久性，这些因素可显著影响NKCE的疗效。目前大多临床前的NKCE都是片段化的结构，它们分子量较小（50-100
kDa），因此具有出色的组织浸润特性和极低的免疫原性。然而，由于肾脏清除和降解，这些小尺寸的NKCE通常缺乏体内持久性，需要频繁输注以维持有效的药物水平（复杂的给药步骤设计也是医生比较头疼的），这将增加治疗费用和患者的依从性。因此，需要既定策略延长这些小尺寸NKCE的半衰期。这些方法也是药物设计中常用的办法。如与血清蛋白结合或融合（半衰期2-4周），或将它们与Fc偶联。将小尺寸NKCE连接到化学聚乙二醇（PEG）上，也可以延长半衰期。将片段结构的NKCE进行多聚化以增加其大小也是一种解决方案，如，AFM13是二聚化两个V结构域来构建的。改造后的IgG形式NKCE通常具有更大分子量，常超150 kDa。虽然较大尺寸会给组织渗透带来挑战，但Fc区可以显着增强它们的半衰期。此外，Fc区域可以募集除了NK细胞外的免疫胞，诱发ADCC、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）等机制，从而增加对肿瘤细胞的杀伤。![]()
改造IgG的多特异性常用具有不同抗原特异性的识别区添加到IgG蛋白C 端或N端。这不可避免地增加了其分子大小，使组织渗透更具挑战性，并可能增强免疫原性。因此，平衡多特异性、组织渗透性和低免疫原性对于开发改造IgG形式的 NKCE至关重要。NKCE的生产系统选择也是一个重要因素，它决定了NKCE的产量和下游工艺的复杂性和成本。最常采用两种宿主系统：细菌系统和哺乳动物系统。细菌系统通常用于产生片段化的NKCE，如linked-scFv 型 NKCE。改造的IgG主要在哺乳动物细胞（如CHO细胞）中生产，因为需要翻译后加工才能成功链配对。细菌系统的特点是廉价、快速和大批量生产，但生产的蛋白质通常需要重新折叠。带有NKCE基因的表达质粒被转化到大肠杆菌，当细菌培养物达到高密度时，诱导NKCE表达，并通过包涵体产生NKCE蛋白。从细菌系统收集原始NKCE蛋白通常需要1-2 天，然后又需要2-3天进行复性和纯化。在哺乳动物细胞系统（如HEK 293T 或 CHO细胞）中表达 NKCE 可以绕过复性，因为这些细胞可以通过上清分泌功正确折叠的NKCE。然而，哺乳动物细胞系统的产量通常低于细菌系统的产量。通常，哺乳动物细胞与编码轻链或重链的表达载体共转染或转导。培养约6天后，收集上清液纯化NKCEs，然后分析链大小和配对。本文参考文献还有几家在开发 NKCE 的公司资料都已上传星球～
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