开发新药是一个复杂的过程，可能需要 12 至 15 年的时间，成本超 10 亿美元。药物发现过程的临床前阶段，从最初的靶标识别和验证，到分析方法开发、高通量筛选、命中识别、先导优化等，最后选择用于临床开发的候选分子。

药物研发的驱动因素是存在未满足的临床需求。最初通常发生在学术界，并提出一个治疗假设，即蛋白质或通路的抑制或激活将在疾病状态下产生治疗效果。由此，确定一个靶标，在进入先导药物发现阶段之前可能需要进一步验证，以证明药物发现工作的合理性（图 1）。在先导药物发现过程中，随后会进行深入的研究，以找到类药性的小分子或生物治疗剂（通常称为候选药物，Candidate）；该药物将进入临床前阶段；如果成功，则进入临床开发阶段（图 2 ）；并最终成为上市药物。

图1. 从靶标识别、验证到候选药物发现过程及预期时间。 

 图2. 药物发现筛选分析概述。

药物在临床上失败的主要原因有两个：第一是它们不起作用，第二是它们不安全。因此，开发新药最重要的步骤之一是靶点发现和验证。靶标是一个广泛的术语，可以是一系列生物实体，例如蛋白质、基因和RNA。一个好的靶点需要有效、安全、满足临床和商业化需求，最重要的是“可成药”。“可成药”靶点可接近推定的药物分子，无论是小分子还是较大的生物制品，并且在结合后引发可在体外和体内可测量的生物反应。

如今可用生物医学数据的数据挖掘导致靶标的显著增加。在这种情况下，数据挖掘是指使用生物信息学方法，不仅帮助识别，而且帮助选择和优先考虑潜在的疾病靶标。可用数据，包括出版物和专利信息、基因表达数据、蛋白质组数据、转基因表型和化合物分析数据。涉及方法，包括检查 mRNA/蛋白质水平，以确定它们是否在疾病中表达以及它们是否与疾病恶化或进展相关。另一种有效的方法是寻找遗传关联，例如，遗传多态性与疾病或疾病进展的风险之间是否存在联系，或者多态性是否具有功能。最后，还可以使用表型筛选来识别疾病相关靶标。

一旦确定靶标，靶标就需要受到全面验证。验证技术的范围从体外工具到动物模型，再到在疾病患者中调节所需靶标。虽然每种方法本身都是有效的，但多重验证方法显著提高了结果的置信度（图 3 ）。

 图3. 靶标识别和验证是多功能的研究过程。

靶标验证常见的技术包括基因敲除、基因敲减、转基因动物模型、单克隆抗体、和化学基因组等多种方法。

在靶标验证过程之后，在药物发现过程的命中识别和先导化合物发现阶段，开发了化合物筛选测定方法。“命中化合物”即是在化合物筛选中具有所需活性且其活性在重新测试后得到确认的化合物。存在多种筛选范例来鉴定命中分子。

高通量筛选(High throughput)，通常在 384 孔及以上的板中测定分析大量化合物。大型化合物库通常由大型制药公司运营，但较小的化合物库也可以在制药公司或学术界运营，这有助于降低成本。商业公司现在还尝试使用计算机辅助分析来覆盖更广泛的化学空间，以减少筛选的化合物数量。

特定文库筛选，先前鉴定为击中特定类别靶标（例如激酶）的化合物、以及具有相似结构的化合物。提供更便宜的途径来寻找命中分子，但可能无法发现全新的结构，并且可能难以获得专利授权。

片段筛选，将小化合物浸泡到晶体中以获得低(mM) 活性的化合物，然后将其用作较大分子的构建模块。

结构辅助药物设计，使用晶体结构辅助设计分子。在这种情况下，通常会将化合物对接到晶体中，并使用它来辅助预测可以在何处添加修饰以提供增强的效力或选择性。

虚拟筛选，使用对接模型：用蛋白质的 X 射线结构筛选虚拟化合物库，或者基于已知的配体的药效团筛选，作为开发进一步化合物的基础。还可以特定文库筛选提供起始结构，而无需使用昂贵的大型库文库筛选。

生理活性筛选，一种基于组织的方法，用于确定药物在组织而不是细胞或亚细胞水平上的作用，例如肌肉收缩力。通量较低的定制筛选。旨在更接近地模拟体内的复杂性，而不是仅仅查看单个读数。

亲和力筛选（包括 DEL库，质谱/核磁共振等筛选），通过与已知蛋白质靶标结合来筛选较小化合物（片段），以寻找具有与靶标结合活性的化合物。

一般来说，细胞测定应用于多种类别的靶标，例如膜受体、离子通道和核受体，并且可根据化合物活性生成活性读数。相比之下，生化测定则主要应用于受体和酶类靶标。也可简单地测量测试化合物对靶蛋白的亲和力。生化和基于细胞的测定的检测范例均已成功用于识别命中分子和候选分子。

测定形式的选择取决于药物靶蛋白的生物学机制、基本的设备仪器基础设施、科学家的经验、是寻找抑制剂或激活剂、及筛选规模等。例如，GPCR 筛选可测定配体与受体的亲和力，可测量 G 蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换；还可以测量化合物介导的信号的变化：许多第二信使，包括钙、cAMP 或磷酸肌醇，或下游报告基因的激活。无论选择哪种检测形式，都需要考虑以下因素：

1. 测定的药理学相关性。如果可行，应使用对所研究的靶点具有活性的已知配体进行研究，以确定测定药理学是否可以预测疾病状态，并表明该测定能够识别所需效力和作用机制的化合物。

2. 测定的重现性。在化合物筛选环境中，要求该测定在各个测定板、各个筛选日期以及可能运行数年的程序内、在整个药物研发的持续时间内可重复。

3. 测定费用。化合物筛选测定通常在微孔板中进行。在学术界或相对少量的化合物测定通常在 96 孔或 384 孔微量滴定板中进行，而在工业或 HTS 应用中，测定在 384 孔或 1536 微孔板中进行格式化，测定体积小至几微升。在每种情况下，选择测定试剂和测定体积以最小化测定成本。

4. 测定质量。测定质量通常根据 Z' 因子确定。这是一个统计参数，除了考虑测定中的信号窗口之外，还考虑测定中高信号和低信号周围的方差。Z 因子已成为测量板基上测定质量的行业标准方法。Z因子的范围是0到1；Z 因子大于 0.4 的测定被认为对于化合物筛选来说是适当稳健的，尽管许多研究组更喜欢使用 Z 因子大于 0.6 的测定。除了 Z 因子测定质量外，还通过在每次测定中纳入药理学对照来监测质量。如果标准化合物的药理学落在预定限度内，则认为测定是可接受的。检测质量受多种因素影响。一般来说，高质量的检测是通过执行简单的检测方案（步骤少）、最大限度地减少检测中的清洗步骤或板与板之间的试剂转移、使用稳定的试剂和生物制品以及确保用于执行检测的所有仪器来创建的。通常通过实验室自动化控制来实现。

5. 化合物在测定中的作用。化学库通常储存在有机溶剂中，例如乙醇或二甲基亚砜 (DMSO)。因此，需要开发对测定中所用溶剂的浓度不敏感的测定。通常，基于细胞的测定不能耐受高于 1% DMSO ，而生化测定可以在高达 10% DMSO 的溶剂浓度中进行。还应确定检测中的假阴性和假阳性命中率。最后，应考虑化合物筛选浓度。用于发现命中的化合物筛选测定通常在 1–10 µM 化合物浓度下运行。在这些浓度下，可以鉴定活性高达 40 µM 的化合物，可以改变测试浓度来鉴定具有更高或更低活性的化合物。

在开发 HTS 测定时（可能需要在几周内筛选数百万个分子），最佳方案是首先筛选化合物的训练集，以验证测定的性能是否可接受。图4 显示了在1536孔HTS测定中针对中国仓鼠卵巢细胞中表达的组胺H1受体的12000个化合物的筛选。通过重复两次或三次，以识别测定中的命中率、测定的再现性以及测定中的假阳性和假阴性命中率。目前，已经开发了统计包来识别这些参数。

当进行筛选以检测激动剂配体时，水母发光蛋白(Aequorin，能够结合游离的钙离子)测定的命中率通常小于筛选化合物的 0.5%，而统计测定截止值为标准激动剂配体所见的激动剂信号的 5% 或更低。在这种检测形式中，假阳性和假阴性的命中率非常低。

对于拮抗剂筛选，水母发光蛋白测定中的命中率通常为以大于 25% 抑制的活性截止，占筛选的化合物的 2-3%。这是所有筛选测定的常见现象。拮抗剂或抑制剂形式的命中率往往高于激动剂测定中的命中率，因为拮抗剂测定（通过检测测定信号的减少来定义）还将检测干扰信号系统产生的化合物。完成稳健性测试后，检测将进入 HTS。在 HTS 期间，每天要筛选多达 200 个检测板，通常使用复杂的实验室自动化技术。在筛选过程中，根据测定板上的 Z' 和标准化合物的药理学差异来测定性能，如果这些质量控制措施超出预定限度，则测定板失败并重新筛选（图 5）。

图4. 水母发光蛋白高通量筛选：验证测试 GPCR 拮抗剂测定（1536 孔）。将表达组胺 H1 受体和钙敏感发光蛋白水母发光蛋白的细胞分配到 1536 孔微量滴定板中。一式两份筛选总共 12,000 种化合物，以检测激动剂配体（左图）和拮抗剂配体（右图）。在激动剂测定（左图）中，没有药物反应以红色表示，对配体组胺最大浓度的反应以蓝色表示，化合物数据以黄色表示。正如激动剂测定中常见的那样，由于不存在假阳性，命中率非常低。在拮抗剂测定中（右图），在不存在测试化合物的情况下对组胺的反应以红色表示（基础反应），对组胺拮抗剂最大浓度的反应以蓝色表示（100%抑制），化合物数据以黄色表示。正如在基于细胞的抑制剂测定中常见的那样，由于测定干扰和化合物活性的结合，化合物数据存在显著的分散分布。真正的活性在 40% 至 100% 抑制范围内相关。两种检测均具有出色的 Z'。

图5. 高通量筛选中的质量控制 (QC)。为了确保化合物筛选活动中筛选数据的控制，每个测定板通常包含许多药理学对照化合物。(A)每个384孔板包含16个含有低对照的孔和另外16个含有EC100浓度的药理学标准品的孔，其用于计算Z'因子。Z' 系数低于 0.4 的板将被重新筛选。(B) 每个板还包含 16 个 EC 50浓度的药理学标准品孔，以监测测定中的差异（菱形）。(C) 为所有通过药理学标准 QC 的板布局生成热图，以监测整个测定板的活性分布。在整个筛选板上看到活动的应随机分布。由于活性孔聚集在板的中心，因此所提供的板将失败并重新筛选。

一般化合物库的分子遵循Lipinski五法则，分子量小于400、和clogP小于 4（亲脂性的量度，影响体内吸收），具有这些特征的分子被称为“类药物”，这是因为大多数临床上市药物的分子量小于 350，cLogP 小于 3。以简单的小分子作为先导物优化来启动药物发现计划至关重要，以提高效力和选择性，通常涉及增加分子量，这反过来又会导致安全性和耐受性问题。

一旦通过虚拟筛选或 HTS 获得了一些命中结果，药物发现团队的首要任务就是尝试确定哪些化合物最适合研究。这种分类过程至关重要，因为在一个大型库中，团队可能会留下许多可能的命中，他们需要减少、确认这些命中并将其聚类为系列化合物。实现这一目标需要采取几个步骤。首先，尽管随着化合物库质量的提高，这不再是一个问题，但文库监管员已知在 HTS 中频繁出现的化合物需要从进一步考虑从中删除。其次，已经开发了许多计算化学算法，根据结构相似性对命中进行分组，以确保在提出的化合物列表中代表广泛的化学类别。使用这些算法对化合物命中列表进行分析，可以根据化学簇、效力和配体效率等因素来选择命中，从而了解化合物与其分子大小的结合效率（对数效力除以“重要原子数”，即分子中的非氢原子）。

下一步，则是对每个命中进行主要测定，并生成剂量反应曲线。命中分子表现出正常的动力学行为很重要。表现出全有或全无响应的化合物不是以可逆的方式起作用，实际上也可能根本不与靶蛋白结合，高浓度下的活性是由样品和测定系统的另一组分之间的相互作用产生的。可逆化合物受到青睐，因为它们的药理作用在停药后更容易“消失”，这是在患者中使用时的一个重要考虑因素。获得剂量反应曲线可以生成半数最大抑制浓度(IC50)，用于比较候选化合物的效力。

新鲜的化合物样品是非常必要的。但几乎所有 HTS 文库都以冷冻 DMSO 溶液的形式保存，因此一段时间后，化合物可能会降解或变性。事实上，当重新合成该化合物并用于重新测试时，有效的活性可能消失，尽管偶尔鉴定出有效的杂质可以取得进展。

通过在对目标的主要测定中生成可靠的剂量反应曲线，该阶段是在二级测定中检查幸存的命中（如果可用），以选择最终命中。这不需要是高通量形式的测定，而是观察化合物在功能反应中的影响，例如在第二信使测定中或在基于组织或细胞的生物测定中。在这种情况下的活性将确保化合物能够调节更完整的系统，而不是简单地与主要测定中使用的分离的且经常工程化的蛋白质相互作用。

在整个确认过程中，药物化学家将寻求将化合物分组，以构成先导系列的基础。作为该过程的一部分，将考虑每个簇的属性，例如是否存在在许多化合物上演变的可识别的结构-活性关系（SAR），即识别具有某些部分的一组化合物或共同的化学基团，并且向该核心结构添加不同的化学基团会产生不同的效力。还将研究化学合成问题。因此，将评估制备的简易性、平行合成的潜在适应性、以及从后期中间体产生多样性的能力。

确定命中系列后，现在可以对多组化合物并行进行研究。这一步将包括快速生成基本的SAR 数据、并定义与活性相关的结构中的基本要素。同时，每个系列的代表性实例将接受各种体外测定，旨在提供有关吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 特性，以及理化和药代动力学 (PK) 的数据（见表１）。此时可能需要进行选择性分析，特别是针对最初制备化合物的目标类型（如果有），也很有用。例如，您可能想要抑制激酶 X，但避免激酶 Y，以减少不需要的体内副作用。此阶段进行的系列数量将取决于可用资源，但理想情况下，考虑到可能的失败，应将多个系列纳入“从命中到先导”阶段，以便顺利进入下一阶段。通常得到的命中分子对药物靶标的效力为 100 nM–5 µM，将启动药物化学项目以进一步提高该分子的效力。

 表１. 早期药物发现的关键体外测定的参考标准

此阶段工作的目的是完善每个命中系列测试分析，以尝试生产更有效和更具选择性的化合物，并具有一定的体内模型中 PD/PK 特性。

将围绕每个核心化合物结构进行深入的 SAR 研究，并进行测量以确定每个化合物的活性和选择性。这需要系统地进行，并且在已知靶标结构信息的情况下，可以应用使用分子建模和 X 射线晶体学和 NMR 等方法的基于结构的药物设计技术，以更快、更有针对性地 SAR 分析。通常还会确定目标蛋白上的结合位点。

此时的筛选包括相对高通量的测定，确定每个分子对靶标的活性及选择性，对已知或预计存在的问题进行测定（图6 )。

 图6. 假定的药物筛选流程。从高通量筛选 (HTS) 到候选分子确定的测定示例。

此外，必须进行更详细的理化和体外ADME 特性分析，这些研究是并行进行的，选择关键化合物进行评估。表 1 显示了要考虑的检测类型以及合适的目标。

溶解度和渗透性评估对于判断或排除化合物作为药物的潜力至关重要，缺乏这两种特性的化合物无论在初级筛选试验中多么有效，都不太可能成为药物。微粒体稳定性是体内代谢酶修饰然后清除化合物的能力的有用量度，也可以使用肝细胞。对 CYP450 抑制进行检查是新化合物是否可能影响与其共同给药的现有药物的代谢的重要预测因素。如果这些特性中的一种或多种不理想，那么可能需要专门针对这些特性筛选更多的化合物。

达到目标效力和选择性的关键化合物，以及大多数理化和 ADME 目标，应在大鼠中进行 PK 评估。在这里，当化合物静脉给药时，通常的目标是半衰期为 >60 分钟，口服给药后吸收超过 20%，尽管有时不同的目标需要非常不同的 PK 曲线。此外，需要考虑潜在毒性，hERG 通道是一种钾电压门控离子通道，对心脏功能和抑制很重要，可导致心脏负担。对于 hERG，我们的理想目标是活性超过 30 uM 或至少 1000 倍的靶标选择性。

许多满足所述要求的这些化合物在 PK 研究中，发现静脉给药后具有合理的半衰期，但当给大鼠口服该化合物时，发现血浆水平较差。研发项目从命中到先导阶段的一些化合物虽然本身不太可能取得进展，但能够回答疾病模型中的问题。因此，化合物可被腹腔内给药，实验结果也为开发方案提供了实质性的证据。

最后，药物发现阶段的目标是保持先导化合物的有利特性，同时改善先导结构的缺陷。此阶段的化合物可被视为已满足先导化合物优化阶段的初始目标，并已准备好作为临床前候选药物之前进行最终表征。

一般来说，分子还需要在遗传毒性模型（例如Ames test）和一般行为的体内模型（例如Irwin's test）中进行检查。高剂量药理学、PK/PD 研究、剂量线性 PK、重复给药 PK、 寻找药物诱导的代谢和代谢谱都需要在此阶段结束时进行。还需要考虑化学稳定性问题和推定原料药的选择。

在此阶段收集到的有关该分子的所有信息将有助于准备目标候选分子资料，与毒理学、化学制造、以及控制考虑因素一起，将构成监管提交的基础，以允许开始人体给药。

行业内只有 10% 的小分子项目可能会过渡到候选分子阶段，在此前多个阶段都可能失败。这些可能包括: (i) 无法进行可靠的检测；(ii) 没有从 HTS 获得可开发的命中分子；(iii) 化合物在二级或天然组织测定中表现不符合预期；(iv) 化合物在体外或体内有毒；(v) 化合物具有不良副作用；(vi) 无法获得符合人体所需给药方案的良好 PK 或 PD 曲线，例如，如果需要每天一次片剂，则需要该化合物具有适合实现此目的的体内半衰期；(vii) 目标位于中枢神经系统内的化合物无法穿过血脑屏障。

此外，尽管与药物开发和临床阶段后期进行的许多流程相比，成本相对较低，但临床前活动的风险足够高，且距财务回报遥远，常常使其成为一个问题。一旦选择了候选药物，进入临床阶段的化合物的流失率也很高，同样只有10％的候选药物进入市场，但在这个阶段失败的财务损失后果要高得多。关于如何通过“快速而廉价地失败”来提高成功率，业界存在相当多的争论。

一旦候选分子达到临床阶段，终止该项目就会变得越来越困难，因为在这个阶段该项目已经成为公众所知，因此终止会影响对公司和股东价值的信心。在临床开发之前进行更多研究，例如改进毒理学筛选（使用失败的药物为这些测定提供信息）、基于全面的疾病理解建立预测转化模型并识别生物标志物可能有助于这一努力。尤其是在后两个领域，学术界与产业界的合作可以真正增加临床前的价值，并最终帮助为患者带来更有效的药物。

参考：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3058157/