近日，宁波大学附属妇女儿童医院出生缺陷综合防治中心李海波团队的“基于大规模外显子组测序数据评估中国人群腺苷脱氨酶2缺乏症的携带者频率和发病率（Carrier frequency and incidence estimation of deficiency of adenosine deaminase 2 in the Chinese population based on massive exome sequencing data）”的研究成果被国际顶尖期刊《Nature Reviews Rheumatology》（IF: 29.4）列为研究亮点（Research Highlights），并以“DADA2 prevalence in China”为题目进行了专栏报道。
腺苷脱氨酶2缺乏症（DADA2，OMIM: 165,688）是一种罕见的常染色体隐性自炎症性疾病，特征为反复发热、早发性中风以及一系列血管病变。该病由ADA2基因的双等位基因功能丧失（LoF）变异引起，可能是纯合子或复合杂合子。自其发现以来，DADA2的临床谱系已显著扩展。诊断依据是基因分析和ADA2酶活性的测定。自2014年由两个独立小组首次描述以来，全球已有超过600例DADA2病例被诊断。截至目前，Infevers数据库已收录116个ADA2基因的可能致病和致病变异（LP/PVs），其中大多数为错义变异、无义变异或剪接变异（https://infevers.umai-montpellier.fr/web/search.php?n=20）。ADA2的相对常见的致病变异包括p.G47R和p.R169Q。尽管DADA2的病理生理机制尚不明确，动物模型研究表明ADA2参与造血细胞的进程和血管完整性的维持，这可能解释了在血管和骨髓中观察到的一些表现。目前，肿瘤坏死因子抑制剂（TNFi）在治疗DADA2的血管炎型中有效，而造血干细胞移植（HSCT）则是对TNFi耐药的患者的有效治疗方案。研究表明，TNFi和HSCT均能有效控制血管炎、发热和缺血性中风。因此，早期诊断和靶向治疗对于预防器官损伤和长期发病率至关重要。
先前的研究估计，DADA2的携带者频率至少为每236人中就有1人，这对应于全球患病率为每22.2万例中1例，全球大约有35,000名DADA2患者。然而，DADA2患者常常未被诊断出来。迄今为止，尚未有大规模的流行病学研究评估中国人群中的携带者频率或估计DADA2的发生率。本研究旨在利用现有的外显子组测序（ES）数据，分析DADA2的携带者频率，并确定DADA2在中国人群中的发生率。
结果
评估中国人群中的ADA2变异
在本研究中，我们分析了覆盖整个ADA2基因（NM_001282225.2）的69,413个外显子组测序（ES）数据。所有潜在的致病性ADA2变异都根据ACMG指南、文献以及公共数据库进行了识别和注释（图1）。我们识别出了30个已报道的以及30个新发现的致病/可能致病变异（PV/LPVs），其中包括22个错义变异、3个无义变异、4个移码变异和1个剪接变异（图2A）。所有已识别的ADA2变异都列在表1中。我们使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN、MetaLR和REVEL评估了错义变异对蛋白功能的潜在影响。除一个剪接变异外，在59个变异中，13个位于外显子2（占22.03%），13个位于外显子3（占22.03%），8个位于外显子4（占13.56%），3个位于外显子5（占5.08%），3个位于外显子6（占5.08%），6个位于外显子7（占10.17%），2个位于外显子8（占3.39%），11个位于外显子9（占18.64%），1个位于外显子10（占1.69%）（图2B）。在这60个变异中，50个是错义变异（占83.33%），5个是移码变异（占8.33%），4个是无义变异（占6.67%），1个是剪接变异（占1.67%）（图2C）。这些59个致病/可能致病变异（PV/LPVs）分布在ADA2的所有结构域中，其中36个位于催化结构域（图2A）。
图1 通过全外显子组测序（包括常规全外显子组测序和临床全外显子组测序）数据识别ADA2基因中杂合PV/LPV的流程图。图中概述了ADA2变异的纳入和排除标准
图2 ADA2杂合变异的综合遗传分析
ADA2酶活性测量的新变异
为了评估22个新的ADA2错义变异的有害效应，我们将含有这些变异和野生型( WT )ADA2的质粒转染到HEK293T细胞中。我们测量了上清液中的ADA2活性，并通过印迹分析了细胞内蛋白表达。我们使用了一个保守的截断值<25%的残余酶活性来定义有害变异。这22个新的错义变异展示了从100%到<0.004%的广泛残余酶活性范围，与WT ADA2对照相比。总体而言，68.18%的错义变异表现出ADA2活性减少>50%。其中，包括c.138_139delGGinsCA（p.Gly47Arg）、c.278 T > G（p.Ile93Ser）、c.293 T > G（p.Val98Gly）、c.342 T > G（p.His114Gln）、c.380 A > G（p.Asn127Ser）、c.389 A > C（p.Tyr130Ser）、c.792G > T（p.Trp264Cys）、c.1069G > C（p.Ala357Pro）、c.1172 A > C（p.His391Pro）、c.1258G > C（p.Asp420His）、c.1404C > G（p.Asp468Glu）、和c.1417 A > G（p.Lys473Glu）这12个变异显示<25%的残余酶活性，并且与WT ADA2相比，ADA2蛋白分泌明显受阻（图3A-B）。这些发现与先前的研究结果一致，表明错义变异的杂合子携带者表现出ADA2活性范围广泛，其中包括正常范围内的值。我们还进行了minigene剪接实验，以验证由c.1240-2 A > G变异引起的可变剪接（图3D-E）。该变异导致突变ADA2中第9和第10外显子的缺失。综合来看，这些数据确认了这12个新的错义变异的有害效应。
图3 新型ADA2错义变异的功能分析及位于3′剪接位点的变异外显子剪接模式验证
携带者频率和疾病流行率的估计
在流行病学计算中，纳入了50例LP/PV样本。值得注意的是，前八种最常见的变异包括c.1065C > A (p.Phe355Leu)（MAF 0.413%）、c.380 A > G (p.Asn127Ser)（MAF 0.022%）、c.100C > T（p.Arg34Trp）（MAF 0.0079%）、c.97dupA（p.T33Nfs*29）（MAF 0.0072%）、c.578C > T（p.Pro193Leu）（MAF 0.0065%）、c.505C > G（p.Arg169Gly）（MAF 0.0065%）、c.139G > T（p.Gly47Trp）（MAF 0.0050%）以及c.505C > T（p.Arg169Trp）（MAF 0.0050%），这些变异共同占总变异的89.75%（表1和表3）。通过将与DADA2相关的变异与那些破坏ADA2功能的变异结合，致病性和功能丧失（LoF）变异的累计等位基因频率为0.005281。中国人群中的总携带者频率为1.05%（732/69,413）。与DADA2相关的ADA2变异的携带频率为95例患者中有1例。排除具有纯合c.1065C > A (p.Phe355Leu)变异的个体后，估算中国DADA2的患病率为1/92,251。这些发现表明，中国人群中ADA2突变的携带频率和DADA2的流行率高于其他人群。
参与者中有50.64%来自上海或北京（表2）。ADA2的携带频率存在地区差异（图2D）。最常见的变异c.1065C > A（p.Phe355Leu）分布于所有地区。上海和北京的DADA2估算发病率为1/108,460，江苏省为1/389,105，浙江省为1/74,349（表2）。此外，ADA2异合子携带者的变异类型在13个地区中表现出区域性差异。
结论
总之，利用来自中国人群的大规模NGS数据集，我们获得了DADA2的精确遗传流行病学估计。ADA2基因在中国人群中的变异谱与其他民族存在显著差异。对DADA2发病率的更准确估算将有助于遗传咨询、早期诊断治疗及预后评估。
