在2015年，美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学会（ACMG/AMP）建立了指导原则，用于系统地对遗传变异进行分类，具体包括：1）致病性变异，2）可能致病性变异，3）不确定意义的变异（VUS），4）可能良性变异，5）良性变异。这些结果由临床遗传检测实验室报告给要求的医疗保健专业人员（HCP），然后由他们将结果传达给患者。值得注意的是，除了可能致病性和致病性变异外，大多数临床遗传检测实验室还报告VUS，VUS被定义为缺乏确凿证据以确定变异的生物学和/或医学意义的基因序列变化。在临床遗传检测报告中，VUS的发现率可高达53%。VUS的结果要求HCP向携带者提供细致的解释，说明为什么该变异被认为是不确定的，并阐明该变异对个体及其家族成员的影响。许多HCP缺乏正规的遗传学培训，这使得他们在解读和传达这些结果时面临困难。即便是在遗传咨询师（GCs）中，如何将VUS结果反馈给患者，或者是否建议改变其临床护理，也会根据个体HCP因素的不同而有所差异，例如他们对自己角色的自我认知、对技能的信心以及工作环境等。
VUS结果需要临床医生和实验室投入大量时间和资源；对家族成员检测构成挑战；并且使得临床试验的入组变得更加复杂，这已成为神经遗传学精准医学中一个日益突出的难题。由于VUS结果的不确定性，建议携带VUS的个体在管理其护理时，不应依赖遗传结果进行临床决策。错误地将遗传发现归因于病因可能导致患者的不必要随访、避免的焦虑，或错误的对分子诊断的过度安慰。然而，VUS仍然必须有效传达，并且可能是额外临床评估和随访的重要指导。因此，反复建议实施临床指南，并将患者的表现型与VUS结果结合，促进临床专家和遗传学团队的多学科协作，这有助于促进变异的适当解读、HCPs对其意义的精准沟通以及适当的患者管理。
在隶属于蒙特利尔神经学研究所医院（The Neuro）的学术机构中，越来越多的非遗传学专家开始接收到VUS结果，这促使了2022年秋季开展了多学科的“VUS讨论会”。该讨论会由临床遗传咨询师（GC）、临床分子遗传学家、以及具有博士及博士后研究背景的科学家组成的专家委员会组成，旨在帮助解读我们神经遗传学患者群体中的VUS。每个变异都由研究科学家（以下简称为生物策展人）进行评估，结合基因组和表型证据类型，内部对变异进行“温度”分类，以评估其潜在的致病性。变异被分类为“VUS Hot”，表示该变异倾向于潜在的致病性；“True VUS”，表示该变异在致病性和良性之间倾向于不偏向任何一方；或者“VUS Cold”，表示该变异倾向于潜在的良性。接着，每两周举行一次VUS讨论会，专家委员会共同讨论并确认最终的内部变异分类。专家团队还合作确定临床管理中的潜在跟进措施，包括对受影响家族成员的基因检测、父母分离分析以确定VUS的阶段或发生情况（遗传或新发），或对患有神经性疾病的个体进行进一步的临床调查。最后，团队讨论了如何将VUS结果传达给受影响的个体及其临床护理团队中的其他医疗保健提供者（HCP）时的细节。
在这里，我们总结了2022年10月至2023年12月期间VUS讨论会计划的成果。该工作强调了变异策展的益处，超越了临床基因检测实验室报告的结果，从而加强了我们对不确定变异潜在影响的理解。我们的目标是概述多学科分子遗传学与临床合作如何改善神经性疾病患者及其家庭的护理，并提升医疗保健提供者（HCP）的临床工作流程。
方法
研究设计
本研究采用了质量改进（QI）研究设计，旨在改善VUS的解读，提升患者预后，并促进医疗保健提供者（HCP）在接收到不确定神经遗传结果的情况下的专业发展。该项目的重点是完善标准患者护理实践的质量，并且不涉及对患者安全、隐私、保密性或权利构成风险的程序。该研究已获得蒙特利尔神经学研究所（The Neuro）专业服务主任的批准，且无需进行机构伦理审查。
VUS的预先整理
遗传咨询师（GCs）为所有神经系统疾病患者分配了一个身份编号，并在VUS Rounds之前向生物策展人提供了相关数据，包括患者表型的广泛描述；所订购的临床遗传检测面板；发现VUS的基因及人类基因组变异学会（HGVS）命名法（编码DNA和蛋白质改变）；VUS的基因型；根据《在线孟德尔遗传学手册》（OMIM）提供的基因相关表型；以及患者的广泛家族史（如适用）。
生物策展人利用遗传咨询师（GCs）提供的信息来评估可能影响变异解释和分类的所有证据线。除了审查与VUS及其所在基因相关的科学文献外，生物策展人还使用了来自各种资源和工具的证据。变异等位基因频率来自一般人群、特定祖先群体和特定疾病数据库，如基因组聚合数据库（GnomAD）v2.1.1和v3.1.2，包括非神经系统疾病队列和特定祖先子集；健康外显子数据集；以及基因组变异数据库。使用了计算工具来评估变异的潜在致病性，如用于错义变异的稀有外显子变异集成学习器（REVEL）和用于剪接、内含子或靠近外显子-内含子边界的编码变异的Splice AI。ClinVar和OMIM用于评估先前关于变异致病性的文献记录。最后，蛋白质组学资源，包括InterPro和AlphaFold蛋白质结构数据库，用于预测VUS是否影响蛋白质功能区域、蛋白质折叠或氨基酸相互作用。基于所有可用的证据，生物策展人将变异分配为以下三种初步分类之一：1）“VUS Hot”，2）“True VUS”或3）“VUS Cold”，如上述定义。
VUS 讨论会
在初步策展后，专家委员会每两周举行一次VUS讨论会。在会议中，生物策展人展示了所有可用的证据，遗传咨询师（GCs）则介绍了任何额外的相关临床细节。经过讨论后，最终为每个VUS分配了一个温度分类。团队随后进行了反复讨论，评估是否通过额外的临床随访能够澄清VUS在携带者临床表现中的作用。随访评估主要针对某些“VUS Hot”或“True VUS”进行，内容包括磁共振成像（MRI）或血液分析，以识别可能与已知基因-疾病关系一致的特征或分离分析，目的是收集足够的证据，以便可能升级变异的分类。对于携带某些“True VUS”或“VUS Cold”的神经系统疾病患者，讨论了转诊至正在进行的研究的可能性，希望能够解决持续的遗传诊断难题。
讨论会结束后，生物策展人将每个VUS的证据摘要和最终分类分发给专家委员会成员。这些资源也可以与医疗保健提供者（HCP）团队共享，以帮助临床随访决策和有效的多学科沟通。这些摘要资源还为医疗保健提供者在向神经系统疾病患者传达VUS结果时提供了参考。
结果
在2022年10月至2023年12月期间，共鉴定出143个VUS，涉及72名神经系统疾病患者（见图1）。这些变异跨越了110个独特基因，其中最常见的是错义变异（n = 109，占76.2%），此外还鉴定出了移码插入/缺失、非移码插入/缺失、剪接变异、同义变异、非翻译区变异、内含子变异和拷贝数变异（见图2A）。
在这143个VUS中，18个被分类为VUS Hot（14.0%），60个为True VUS（40.6%），65个为VUS Cold（45.4%）。REVEL计算预测评分被用来评估所有错义VUS的潜在致病性。不出所料，VUS Hot的平均REVEL评分（0.785，标准差 = 0.170）高于该方法作者定义的“中等致病性”阈值，并且显著高于True VUS（0.366，标准差 = 0.243；p = 2.92e-05）和VUS Cold（0.342，标准差 =
0.278；p = 6.40e-06）的平均REVEL评分。然而，VUS Cold的平均REVEL评分与True
VUS的平均REVEL评分之间并没有显著差异（p =
0.354；见图2B）。在ClinVar中查询时，大多数变异之前被报告为VUS，或在数据库中缺失，无论其内部分类如何（见图2C）。没有任何VUS被ClinVar报告为可能致病或致病，然而，一例True VUS（1.7%）和六例VUS
Cold（9.2%）曾被报告为可能良性或良性。最后，VUS
Cold的gnomAD v2.1.1等位基因频率的平均值（3.64e-04，标准差 = 1.55e-03）显著高于True VUS（6.65e-05，标准差 = 3.28e-04；p = 5.94e-03）和VUS Hot（4.65e-06，标准差 = 7.50e-06；p = 0.013），而VUS Hot的平均等位基因频率与True VUS的平均等位基因频率之间没有显著差异（p = 0.555；见图2D）。
在72名携带VUS的神经系统疾病患者中，16名携带至少一个VUS Hot（22.2%），44名携带至少一个True VUS（61.1%），40名携带至少一个VUS Cold（55.6%；图3A）。大多数VUS（n = 33）是在神经退行性疾病患者中发现的（图3B）；尽管如此，每个表型组中识别到的VUS数量与该组个体数量大致成比例。同样，VUS的分类在14个表型组中相对均匀分布。
我们还追溯性地评估了影响最终VUS分类的关键特征（图5）。我们发现，其中27个VUS（18.9%）缺乏足够的证据来支持其致病性的判断，因此无法做出分类决定。毫不意外地，26个被分类为True VUS。剩下的一个变异被分类为VUS Cold，因为它位于一个与该携带者表型不匹配的疾病相关基因中。
有趣的是，缺乏基因-疾病预期关联与神经系统疾病患者的表型匹配是一个常见特征，适用于41个VUS（28.7%）。其中16个被视为True VUS，25个被归类为VUS Cold。其他常见的分类特征包括VUS位于与先前报告的致病性变异不同的序列区域中或基因的不同区域（n = 45，31.5%）；VUS的等位基因频率高于一般人群、特定族裔或基于疾病流行率的疾病特定数据库中预期的频率（n = 24，16.8%）；VUS的合子状态与基因-疾病关系定义的预期遗传模式不匹配（n = 15，10.5%）；以及VUS位于一个与个体神经系统疾病没有明确的单基因关系的基因中（n = 11，7.69%）。总体而言，这些特征在将变异分类为VUS Cold时影响最大（图5）。
结论
多学科合作使我们能够明确神经科患者在收到VUS基因检测结果后可能需要的随访分析的数量和类型。此外，我们的经验突显了制定标准化VUS指南的机会，以适应临床检测工作流程。将VUS讨论纳入医疗实践，尤其是在非遗传学专科中心，可以确保知识的公平传播，并有效地将不确定的基因结果融入患者护理中。通过系统地将多学科合作纳入VUS审定，我们能够推动全面的遗传咨询和个性化的临床管理，最终通过追求适当和有效的患者护理，减少不必要的医疗系统成本。
