摘要
WD重复结构域45(WDR45)的致病性变异导致脑铁积累5型(NBIA5)的神经变性，其特征是成年后进行性神经退化和脑铁积累。NBIA5患者的早期诊断很困难，因为他们在儿童期通常只表现出非特异性发育迟缓，但这对终身医疗管理至关重要。我们使用Sanger测序调查了32名编码WDR45变异发育迟缓的女性。还进行了全基因组测序(WGS)和X染色体失活(XCI)分析。我们确定了两种致病变异，其中一种是新的终止密码子缺失(stop-loss)变异c.1051delG(p.Val351CysfsTer60)，在一名婴儿早期患有严重发育迟缓并伴有癫痫性痉挛的女性中。XCI分析（我们最初开发)表明白细胞中存在随机模式。WGS未发现任何其他致病性变异，包括两个铁转运蛋白基因中的变异。结合我们之前在WGS研究中的发现，WDR45变异占发育迟缓女性的12%(6/51)，这表明WDR45是发育迟缓女性的主要基因。WDR45的致病性变异导致各种表型，这些表型不一定与变异类型或XCI偏斜模式相关。
引言
WD重复结构域45(WDR45)位于Xp11.23上，编码一种在自噬途径中起作用的蛋白质，自噬途径是主要的细胞内降解系统。WDR45的致病性变异导致神经退行性变伴脑铁积累5型(NBIA5;OMIM：300894)，主要发生在女性患者中。在成年期，患者在脑部MRI扫描中经常表现出进行性运动障碍、认知能力下降和苍白球和黑质中的铁蓄积。这些特征可以提示临床诊断和有针对性的分子检测。在儿童时期，NBIA5患者表现出多种表型，包括发育迟缓、智力障碍(ID)、Rett样刻板运动和癫痫性脑病。这些表型是非特异性的，因此仅根据临床症状和检查很难诊断NBIA5。然而，早期诊断对于NBIA5患者的医疗管理很重要。
在具有多种神经系统症状的未确诊儿科患者中，WDR45致病性变异可能是原因。以前，我们对45名ID患者进行了全基因组测序（WGS），其结果表明ID.4在初始分析中没有明显因果突变的患者使用更新的管道进行重新分析，我们发现了4例具有致病性WDR45变异的患者（4/45，8.9%）。这些病例是在对Rett综合征或Rett样表型患者的平行研究中报告的，促使我们假设WDR45可能是具有特定表型的女性ID的主要基因。在这里，我们建立了一个由来自日本ID收藏的600多个家庭的32名女性ID患者组成的队列，并进行了有针对性的WDR45分析。此外，为了描述HUMARA和FRAXA基因座上均无信息纯合状态的家系中的X染色体失活（XCI）状态，我们开发了一种基于甲基化特异性PCR的XCI分析方法。
结果
队列临床概述本研究
纳入32名女性患者。患者临床信息摘要见表1。在超过一半的患者（19/32，59%）中观察到癫痫。分别在10例和8例患者（10/32，31%;8/32，25%）中观察到刻板动作和自闭症谱系障碍，其中3例表现出两种表型。异常MRI表现包括脑萎缩、带异位、胼胝体发育不全和髓鞘形成延迟。
已识别的WDR45变异概述
我们在两名注册时年龄为2-4岁的患者（2/32，6.3%）中确定了两种致病性WDR45变异，c.1051delG(p.Val351CysfsTer60)和c.868C>T(p.Gln290Ter)。后者表现出刻板的运动和癫痫，之前有报道。
新发c.1051delG变异病例
介绍患者是一名2岁的日本女性，由非近亲父母在足月出生，是他们在登记时进行微受精后的第一个孩子。她的出生体重、身高和头围分别为3078克（+0.69SD）、50厘米（+0.77SD）和33.6厘米（+0.31SD）。患者从婴儿早期开始就表现出智力迟缓。她在4个月大时实现了滚动，在5个月大时实现了头部控制;此后，她的运动和精神运动发育保持不变。在1岁零6个月大时，她经历了痉挛并被诊断出患有癫痫。她在Enjoji婴儿发育量表和Kinder婴儿发展量表上的发育商数得分分别为22分和14分。她在患有生酮性低血糖症后从8岁开始管饲，并在11岁时接受了脊柱侧弯手术。12岁时，她卧床不起，无法说出任何有意义的词语。她的身高为148.5厘米（-1.4SD），体重分别为34.8公斤（-0.9SD）。实验室检查结果显示，她2年时的血清铁为79μg/dL，处于最佳范围内。未检查有关铁代谢的其他项目，但她的血红蛋白为123至144g/L，这并不表明铁代谢异常。2岁时的脑部MRI显示脑萎缩和髓鞘形成严重延迟（在线补充图3）。12岁时的随访MRI显示T2WI上苍白球和黑质信号强度低，这是在NBIA5患者中观察到的典型特征（在线柔软的心理图3）。
基因检测
家系三人Sanger测序证实了杂合核苷酸缺失的新发NM_007075.3（WDR45）：c.1051delG，(p.Val351CysfsTer60)，这可能导致移码和终止密码子缺失变异（图1A）。根据美国医学遗传学学会（ACMG）指南（PS2、PM2、PM4），该变异被归类为“可能致病性”。WGS未鉴定出任何其他致病性变异，包括两个铁转运蛋白基因二价金属转运蛋白（DMT1）和铁转运蛋白（FPN）中的变异。该变异已提交给ClinVar（入藏号：SCV004697536）。在CACNA1F基因位点使用甲基化特异性PCR与来自外周血的基因组DNA进行XCI分析，在该患者中形成随机模式（图1B）。
图1
讨论
我们在32名女性ID患者中的2名（6.3%）中发现了2个WDR45变异。连同我们之前在重新分析的WGS研究中19名女性患者（总共45名患者）的4个WDR45变异的发现，女性ID患者的累积WDR45致病性改变发生在51名个体中的6名（12%），显然表明WDR45是女性ID的主要致病基因。这一发现也与之前的报道一致，即在MECP2变异阴性的Rett综合征或Rett样表型患者中，致病性WDR45变异的鉴定率为2.5-9.5%。在本研究中，一名WDR45变异患者表现出刻板运动，而另一名早发性癫痫患者则没有。因此，WDR45变异可导致具有广泛临床光谱的女性ID。
值得注意的是，一名具有新的移码WDR45变异的女性患者从婴儿早期开始就表现出严重的发育迟缓。尽管WDR45致病性变异患者表现出不同范围的发育迟缓，但他们大多在消退前实现独立下垂行走。对123名WDR45致病性变异患者的分析表明，大约90%的患者在1岁时实现了滚动，80%的患者在3岁时实现了独立行走，大约60%的患者在3岁时获得了有意义的单词。
与具有WDR45变体的儿童的这种常见趋势相比，本病例似乎显示了最严重的WDR45相关表型形式。同时，也有报道称具有类似严重表型的罕见患者。因此，我们认为她特别严重的表型仍在当前WDR45相关疾病的临床范围内。本病例没有可能影响其临床表现的围产期事件。此外，通过WGS和基于微阵列的比较基因组杂交未检测到其他致病性变异，包括SNV和CNV。
鉴定的变异c.1051delG(p.Val351CysfsTer60)可能引起密码子351的替换，消除末端11个氨基酸残基和推定的终止密码子，并翻译成具有60个残基的3′UTR。在使用NCBI保守结构域搜索（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）和PROSITE（https://prosite.expasy.org/）的计算机预测分析中，在这些新获得的多肽中没有发现潜在的功能域。在携带基本相同延伸氨基酸残基的其他三种情况下，也报道了类似的止损变体;其中2例描述了临床细节（在线补充表2）。一名患者在1岁零6个月时可以独立行走并说出有意义的单词。另一方面，另一名患者表现出轻度运动障碍、发育迟缓和自闭症谱系障碍，能够走路、骑自行车、滑冰和接受特殊教育的学校，明显显示出比本例更温和的表型。这些发现表明，随着延伸的止损变异的临床表型各不相同。
鉴于具有类似终止密码子缺失WDR45变异的病例的严重程度各不相同，扩展多肽不太可能获得独特的毒性功能增强(gain of function)或显性负性突变效应(dominant negative effects);相反，它们可能只是减轻WDR45的自噬活性，类似于其他突变异。
另一个可能影响临床严重程度的因素是XCI状态的偏斜，其中不利的偏斜可能导致严重的表型。然而，在本病例中，外周血DNA的XCI表明存在随机模式。据报道，在三名WDR45变体患者中，突变等位基因在淋巴母细胞样细胞系中的单等位基因表达显示出不利的偏斜XCI模式。然而，他们的临床表现，包括发育迟缓，比本病例更温和。另一名具有截短WDR45变异且表现出严重发育迟缓的患者具有随机XCI模式。综上所述，偏斜XCI可能不是儿童WDR45相关表型严重程度的主要决定因素，至少在外周血中是这样。
缺乏的WDR45会损害铁蛋白自噬，这是一种铁蛋白特异性自噬，有助于控制细胞内铁代谢。在失调的铁蛋白自噬下，活性亚铁变得太短而无法用于关键的生化反应，从而引起神经系统症状。为了应对无序的铁蛋白自噬，WDR45缺陷细胞改变了与铁流入和流出相关的跨膜蛋白的水平，例如DMT1和FPN。因此，NBIA5的临床严重程度可变可能归因于残留活性亚铁的细胞内水平和代偿机制的疗效。在我们的案例中，未鉴定出DMT1和FPN的外显子或经典剪接变异，并且铁蛋白自噬紊乱的代偿机制与临床表型程度的关联仍不清楚。也可能存在影响WDR45相关疾病表型变异的未知因素。
总之，我们发现WDR45是女童ID的主要致病基因。他们的临床表型可以是可变的和非特异性的;因此，应将基因检测视为主要诊断性检查。我们在一名女性患者中发现了WDR45的一种新的止损变异，该患者在WDR45变异的广泛临床谱中表现出最严重的一端。
目前，这种严重表型的分子机制尚不清楚，因为至少有另外两例具有类似终止密码子缺失获得延长多肽的病例没有表现出如此严重的表型，XCI状态和铁转运蛋白基因的改变都与临床无关严重程度。
