摘要
目的：描述一组疑似线粒体疾病（MD）的危重婴儿和儿童的诊断和临床结果，这些婴儿和儿童作为国家计划的一部分接受了超快速基因组检测。
方法：对454个家系进行超快速基因组测序（基因组测序：n=290，外显子组测序+/-线粒体DNA测序：n=164）。在91个个体中，考虑了线粒体疾病，使用线粒体疾病虚拟基因panel进行分析。对这些个体进行回顾性审查，并根据改良的奈梅亨线粒体疾病标准进行评分。
结果：47%（43/91）的个体得到诊断，其中40%（17/43）有线粒体疾病。另外7名未怀疑线粒体疾病的个体在更深入的分析后被诊断为线粒体疾病。发现了两个新的疾病基因，其致病性通过靶向功能研究（CRLS1基因和MRPL39基因）得到验证。功能研究使另外4个个体能够得到诊断。在最终被诊断患有线粒体疾病的24人中，79%的管理发生了变化，其中包括53%的护理被重定向到姑息治疗。
结论：急性患病婴儿和儿童线粒体疾病的超快速基因诊断对于指导有关是否需要额外检查和临床管理的决策至关重要。
关键词：线粒体疾病;快速基因组学;儿科;新生儿
引言
线粒体疾病（MD）是一组临床和遗传异质性疾病，它们通过影响氧化磷酸化直接破坏线粒体能量产生，或通过线粒体稳态或其他细胞功能间接破坏线粒体能量产生。出生时线粒体疾病的最低患病率估计为1/5,000。
线粒体疾病的临床表现差异很大，可在任何年龄出现。线粒体由核基因组和线粒体基因组编码，但大多数（~75%）儿科发病的线粒体疾病是编码的核基因致病性变异的结果。鉴于线粒体在所有有核人类细胞中普遍存在，线粒体疾病可能表现为孤立的器官受累或多系统受累，主要（但不限于）影响具有高能量需求的器官。儿科发病疾病通常表现为严重、快速进展的多系统表型，新生儿发病的死亡率高达15-41%。
从历史上看，线粒体疾病的诊断依赖于临床和放射学特征、生化标志物和侵入性组织分析的组合。然而，尽管进行了广泛的检查和漫长的诊断过程，许多患者仍然没有得到分子诊断。基因组测序改变了疑似线粒体疾病患者的诊断途径，现在正在被纳入临床实践标准。尽管如此，由于巨大的遗传异质性、有限的表型-基因型相关性以及核和线粒体基因组的潜在参与，线粒体疾病的诊断仍然具有挑战性。线粒体疾病可以显示多效性，其中同一基因中的致病性变异可以与多种表型相关。相比之下，Leigh综合征等单一表型具有很大的遗传异质性，其中多个不同基因的致病性变异可能是致病因素。儿科发病的线粒体疾病与“线粒体模拟物”，即其他神经退行性和神经肌肉疾病有显着的临床重叠，因此很难仅根据临床表型缩小诊断。
鉴于这种复杂性，靶向基因测序panel可能不是最适合儿科发病线粒体疾病的检测方式。相反，外显子组测序（ES）和基因组测序（GS）在线粒体疾病诊断中的应用以及多组学panel的整合提高了的诊断率，并发现了许多新的线粒体疾病基因。ES仅限于核基因组的蛋白质编码区，而GS用于对个体的整个基因组（核和线粒体）进行测序，包括编码区和非编码区。最近，英国的最佳实践指南建议将家系、基因不可知的ES或GS用于儿科患者疑似线粒体疾病紧急转诊的一线检测。
在急诊儿科中，获得快速分子诊断的需求很高，因为它有可能对临床决策产生重大影响，允许对少数患者进行精确治疗，并防止对其他人进行不必要的侵入性检查。虽然大多数线粒体疾病没有针对性的治疗，但快速明确的诊断可以防止不必要的检查，例如侵入性肝脏和肌肉活检，并且可能有助于评估预后以及指导关于护理目标的讨论，防止不必要的痛苦，并且可能具有很大的成本效用。
一系列医疗保健系统中的多项研究现已确立了快速基因组检测对病情危重的新生儿和儿科患者效用的证据，并且快速检测越来越多地纳入标准实践。然而，其效用，特别是患者亚群，包括疑似线粒体疾病的患者，需要进一步探索。澳大利亚基因组学急性护理计划是一项全国性研究，为患有遗传病的危重婴儿和儿童提供超快速分子诊断。在这里，我们报告了一组接受超快速基因组检测的患者的诊断和临床结果，其中线粒体疾病被认为是鉴别诊断验前的一部分，或者线粒体疾病是最终诊断，尽管不被视为前测验。
结果
参与者在454个家系中进行了超快速基因组测序（GS：n=290;ES+/-mtDNAseq：n=164）。在91例中，考虑了线粒体疾病，促使纳入线粒体疾病基因面板的详细分析。在这91例病例中，65个家庭接受了GS，而26个家庭接受了ES，其中9/26人由于专家患者批准小组确定高度怀疑线粒体疾病而接受了mtDNAseq（图1）。93%（85/91）的家庭进行了三重分析，由于父母一方不可用，有6个家庭作为二人组。在这个子队列中，同意时的中位年龄为102天（范围：1天–17岁），其中36%（33/91）的参与者年龄在1个月以下（图2a）。43名参与者是女性。百分之七十六（69/91）的参与者在同意时入住儿科重症监护病房(PICU)或新生儿重症监护病房(NICU)。家庭具有不同的血统，12%（11/91）的家庭自我报告了血缘关系（图2b）。
诊断检出率
91例个体中有47%（43/91）做出明确诊断（表1，补充表2和3）。使用ES实现了10例诊断，另外2例来自mtDNAseq诊断。31例为通过GS诊断。欧洲和亚洲参与者的诊断率为44%，近亲家庭的诊断率略低（36%）。
表1
线粒体诊断
40%（17/43）的确诊患者做出了明确的线粒体疾病诊断（表1）。在整个澳大利亚基因组学急性护理队列中，在鉴别诊断中最初未考虑线粒体疾病的情况下，经过更深入的分析后，发现另外7名参与者患有原发性线粒体疾病。总共发现24人明确诊断为线粒体疾病（表1），占整个澳大利亚基因组学急性护理队列中分子诊断的12%（24/204）。在明确的线粒体疾病诊断中，22例由核基因引起，2例由mtDNA缺失引起。在22例核基因诊断中，17例遵循常染色体隐性遗传，3例为X连锁遗传。在两个无关的个体中发现了DNM1L基因（MIM#603850）的杂合变异，DNM1L基因与常染色体显性和隐性遗传疾病有关。
非线粒体诊断
91名参与者中有26名患有非线粒体诊断，其中25名由已知疾病基因引起，以前与线粒体疾病无关，1名检出单亲二倍体15q14q23（补充表2）。在这26人中，有9人被诊断出患有先天性代谢病。
功能验证
在10个个体中鉴定出已知或潜在线粒体疾病基因中意义不确定的变异（VUS）（表2和补充材料3）。在其中7个个体中，进行了额外的功能研究以验证已知或新疾病基因中的VUS，以确保线粒体疾病的分子诊断（表2）。报道了与A1431018相同的CRLS1变异的另一个个体纯合子的心磷脂水平和RNA测序，提供了致病性的证据。
表2
新型线粒体疾病基因
在计划过程中确定了两个新的线粒体疾病基因，通过靶向功能研究验证了致病性，CRLS1和MRPL39这两个基因随后都已发表。在具有与Leigh综合征（MIM#256000）一致的表型特征的个体（A0131098）中鉴定出PYROXD2中的复合杂合变异（MIM#617889）。进行的功能研究提示核糖体缺陷。然而，随后对基因组数据的常规重新分析确定了MRPL39中的双等位基因致病性/可能的致病性变异。MRPL39变异最初在原始基因不可知分析中被过滤掉，因为其中一种变异是深度内含子。MRPL39基因是在2023年发表的病例系列后才被确定为疾病基因，其中包括来自该亚队列的另一名个体（A0331018）;深度内含子变异是复发性的。正在进行的进一步工作以确定个体A0131098是否患有双重诊断或单一诊断。
表型
在447名个体的子队列中共报告了264个HPO术语（91个独特术语），每个参与者的中位数为5个（范围1-14）个HPO术语。最常见的HPO术语是HPO：0001250：癫痫。在最终诊断为线粒体疾病的24名患者中，每个参与者的HPO术语中位数为5（范围1-8）。最常见的HPO术语是HPO：0001928：血清乳酸增加。图2d显示了患有明确线粒体疾病的个体受影响的HPO祖先系统。58%（14/24）被诊断患有线粒体疾病的患者在同意时年龄不到1个月，中位年龄为13.5天（图2a）。1个月以下婴儿的亚队列诊断率为58%（19/33），而1个月至18岁儿童的诊断率为41%（24/58）。
58%（14/24）被诊断患有线粒体疾病的患者在同意时年龄不到1个月，中位年龄为13.5天（图2a）。1个月以下婴儿的亚队列诊断率为58%（19/33），而1个月至18岁儿童的诊断率为41%（24/58）。
改良奈梅亨线粒体疾病标准
改良线粒体疾病标准评分的回顾性应用发现，在最终诊断为线粒体疾病的患者中，没有一个被归类为明确的线粒体疾病，13%（3/24）为可能的线粒体疾病，67%（16/24）为可能的线粒体疾病。明确诊断线粒体疾病和非线粒体诊断的个体之间的平均改良MDC评分无显著差异（P=0.5）。平均改良MDC评分在明确诊断为线粒体疾病的个体和仍未解决的个体之间也没有显着差异（P=0.07）（图2c）。在14例患有线粒体疾病的新生儿（<1个月大）中，64%（9/14）被归类为可能的线粒体疾病，36%（5/14）被归类为不太可能的线粒体疾病。
对临床护理的影响
在最终诊断为线粒体疾病的24人中，报告的中位时间为2.87天（范围2.18天-5天），ES报告的中位时间为3.1天（范围2.8天-5天）和GS为2.37天（范围2.18天-4.1天）。线粒体疾病的明确诊断改变了79%（19/24）参与者的临床护理。在5例病例中，诊断允许进行特定的药物或饮食干预。例如，两名丙酮酸脱氢酶缺乏症患者开始生酮饮食，并且由于丙戊酸钠与暴发性肝功能衰竭有关，因此避免使用POLG中双等位基因致病变异的患者（MIM#174763）。线粒体疾病的分子诊断指导了与临床医生和家庭的讨论，导致42%（10/24）的参与者将护理转向姑息治疗。在亚队列中，非线粒体诊断也导致69%（18/26）的个体的管理发生变化。
讨论
我们描述了一组疑似患有线粒体疾病并作为国家计划的一部分接受了超快速ES+/-mtDNAseq（2018-19）或GS（2020-22）的危重婴儿和儿童的诊断和临床结果。通过快速基因组检测，神经代谢表型已被证明具有很高的诊断率，线粒体疾病在急性患病的婴儿和儿童的诊断中占很大比例。在整个急症护理队列中，线粒体疾病诊断占所有诊断的12%。在这个由91人组成的疑似线粒体疾病亚队列中，47%（n=43）和40%（n=17）被发现患有线粒体疾病的人确定了明确的分子诊断。欧洲和亚洲参与者的诊断率均为44%。其他种族群体的参与者人数要少得多，因此很难得出重要的结论，但总体而言，非欧洲参与者的诊断率与欧洲参与者相似，为45%。
先前对做过ES的疑似线粒体患者的队列研究报告称诊断率范围为35-70%。相比之下，三个做过GS研究报告称诊断率为31-55%。这些队列中的巨大差异可能反映了患者群体和选择标准，在临床异质性更强的患者群体中，较大的队列通常具有较低的诊断率。最近一项关于罕见病人群基因组检测的荟萃分析报告称，GS和ES之间的诊断率相似。在这个亚队列中，接受ES的个体的诊断率为46%，而接受GS的个体的诊断率为48%。此外，对于最终被诊断患有线粒体疾病的个体，报告ES或GS的时间没有显著差异。Mt DNAseq仅在ES队列中的一些个体中完成，以临床怀疑程度为指导。两名乳酸升高和全血细胞减少症的新生儿被诊断为mtDNA大片段缺失。在其他儿科队列中也有早发性mtDNA疾病的报道，这表明应考虑将mtDNAseq或GS作为一线检查，以确保不会漏诊这些疾病。
虽然该亚队列的总体诊断率（47%）与先前报道的ES和GS队列相似，但线粒体疾病基因诊断的比例（40%）通常较低，尤其是与较小或高度特征的队列相比。然而，我们的发现更类似于在两个较大的异质队列中获得的结果，分别有345个家庭和503个个体，其中线粒体疾病疾病基因的诊断率分别为37%和26%。在我们的研究中，26人还被诊断出患有非线粒体疾病，其中几人患有先天性代谢缺陷或神经系统疾病，具有类似于线粒体疾病的特征。此外，当最初不被视为鉴别诊断时，有7人被确定患有线粒体疾病。这可能反映了新生儿和儿童发病线粒体疾病及其重叠表型拷贝急性表现的显着临床变异性，以及该亚队列的回顾性。纳入是通过转诊临床医生启动线粒体疾病虚拟基因panel来确定的。鉴于线粒体疾病的临床异质性，它通常被认为是急性患病新生儿或儿童的鉴别诊断。临床医生对线粒体疾病的怀疑可能从低到相对较高不等，具体取决于临床表现和他们自己的线粒体疾病临床经验。
先前的研究表明，通过专家表型分析以及根据使用临床、生化、成像和组织发现的评分系统（例如MDC评分）评估个体患有线粒体疾病的可能性，可以提高从基因组测序中获得的诊断率。据报道，MDC评分的增加与线粒体疾病和非线粒体诊断（如神经退行性疾病和神经肌肉疾病）的诊断率增加有关，这可能反映了继发性线粒体功能障碍。在这项研究中，虽然诊断为线粒体疾病的个体的平均MDC评分略高，但线粒体疾病诊断、非线粒体诊断和未解决的患者组之间的MDC评分没有显着差异。没有个体具有明确的MDC评分，只有少数个体具有可能的MDC评分。在这项研究中，MDC评分由转诊临床医生（在急性临床环境中可能时间不足）应用的HPO术语回顾性确定，在某些情况下，只有一两个HPO术语输入。虽然MDC评分是为表型仍在演变的儿童量身定制的，但在急性表现中，个体可能没有表现出许多临床特征，并且可能没有进行广泛的神经放射学或组织学组织病理学研究。在这个亚队列中，没有个体有组织病理学或生物化学，很少有人有神经影像学，这限制了他们的MDC评分潜力。鉴于线粒体疾病的异质性，MDC评分不太可能专门涵盖所有线粒体疾病个体，并且有人建议基因组分析不应局限于可能或确诊线粒体疾病的个体，因为可能会遗漏一些线粒体疾病诊断。
新生儿发病的线粒体疾病可能占儿科线粒体疾病病例的30%。然而，急性患病新生儿的诊断存在局限性，因为广泛的表型分析或使用评分系统可能并不总是导致对线粒体疾病的强烈怀疑，因为并非疾病的所有特征都可能已经进化，并且可能很难确定临床特征是与围产期事件相关的短暂特征还是由于潜在的单基因疾病。尽管存在这种复杂性，但先前对疑似线粒体疾病队列的基因组研究表明，在不到一岁时发病的儿童的诊断率更高，之前的两项研究报告称，新生儿亚组的诊断率分别为63%和64%。在我们的子队列中，56%被诊断患有线粒体疾病的个体年龄不到一个月，尽管64%的人只获得了可能的线粒体疾病评分，36%的人被评为不太可能的线粒体疾病。有理由认为，鉴于解释新生儿表型特征的挑战，以及与非线粒体疾病的显着重叠，应考虑靶向虚拟基因列表和与基因无关的基因组方法的组合，因为对表型驱动假设的依赖较少。此外，这种方法允许更广泛的评估，增加了诊断线粒体表型拷贝的可能性，这可能是可以治疗的，同时增加了发现新疾病基因的可能性。
可以说，虽然基因组测序应该是儿科发病线粒体疾病的一线检查，但多组学panel的整合和组织样本的使用对于验证新型或已知疾病基因中的VUS非常重要。本研究中的几个个体需要功能测定（临床认可和研究测定的组合）来验证其变异的致病性，并发现了两个新的线粒体疾病基因。RNA测序和蛋白质组学已越来越多地被证明为疑似线粒体疾病的个体提供额外的诊断价值。然而，这些功能研究通常是消耗的时间，可能需要来自临床相关组织的侵入性样本，并且在临床环境中可能无法获得。重要的是要改进将这些研究整合到诊断管道中，以便可以在具有临床意义的时间表内完成验证，尤其是在急性患病的新生儿和儿童中。为了实现这种整合到诊断报告中，“组学”方法必须标准化并获得临床认可。此外，在重症监护环境中，需要使用易于接近的组织完成检测，这些组织具有许多具有线粒体功能的蛋白质的适当表达，以提供快速结果。这依赖于创建注释良好的参考数据集，以根据基因组检测中感兴趣变异的存在与否选择合适的组织和方法，以及适当的基础设施和计算模型来协助分析和解释多组学数据层。目前，转录组学比蛋白质组学更先进，这可能是由于与基因组学的计算相似性以及大型数据集的存在。
临床医生报告的快速基因组检测在罕见病队列中的临床效用范围为24100%，并表明早期诊断可以改善患者和家庭的预后并降低护理成本。虽然只有少数线粒体疾病进行精准治疗，但研究报告称，在确定线粒体疾病的分子诊断或可治疗的线粒体疾病表型检查方面具有临床效用。在这个亚队列中，线粒体疾病的早期分子诊断改变了大多数患者（79%）报告的临床轨迹。这包括特定的药物或饮食干预、适当地转诊至专业团队，以及避免侵入性检查和潜在的麻醉风险。此外，还发现了许多可治疗的非线粒体疾病，包括先天性代谢缺陷，例如糖原贮积症。
在急性情况下，精确的诊断可以减少家庭诊断的不确定性，并允许预测，这可以促进关于护理目标的艰难对话。新生儿重症监护室（NICU）的家庭报告说，基因组测序使他们能够优先考虑与孩子共度时光。在罕见遗传病患者队列中，线粒体疾病的诊断已被证明可以指导姑息治疗的讨论并避免侵入性检查和治疗，例如肝移植。在这项研究中，快速分子诊断指导临床医生和家庭之间的讨论，将护理重定向到10个具有明确线粒体疾病的家庭的姑息治疗。分子诊断很可能可以恢复家庭的生育信心，并且那些患有常染色体隐性遗传病的人已被证明可以做出积极的决定，例如产前诊断或植入前基因检测。在这项研究中，一名被诊断患有隐性线粒体疾病的个体的母亲在结果披露时怀有双胞胎，随后接受了产前诊断，确定胎儿未受影响。
随着基因组测序在线粒体疾病中的广泛使用，分子诊断的价值也将体现在线粒体学界知识的进步、家族自然病史的发展和以及准确预后信息的获取等方面。
结论
在该队列中，超快速GS和ES+/-mtDNAseq在47%的疑似线粒体疾病的危重新生儿和儿科患者中明确了诊断。其中，40%被诊断为线粒体疾病，突出了线粒体疾病的异质性，尤其是在急性情况下。本研究发现，MDC评分在评估新生儿线粒体疾病可能性方面的效用有限，鉴于解释急性患病新生儿或儿童的表型存在挑战，应考虑广泛的基因组检测策略以促进及时诊断。
快速基因组测序对于罕见病已经得到充分证实，鉴于在我们的子队列中具有很高的临床效用，本研究支持其用于诊断疑似线粒体疾病的急性患病新生儿和儿科患者。
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