p53 是一种重要的转录因子，通过细胞周期停滞、衰老和凋亡等机制抑制癌细胞的增殖能力。TP53 基因的突变出现在大约一半的癌症中，并且作为种系突变会导致Li–Fraumeni 综合征。尽管这些突变具有预后意义，但将 TP53 突变整合到临床决策中仍然受到其突变复杂性的限制。大多数 TP53 突变为错义突变，已识别出超过 2000 个突变，主要集中在 DNA 结合域（DBD）区域。尽管十大最常见（也是研究最多的）“热点”突变约占所有病例的 30%，其余约 70% 的突变尚未被充分表征，这使得预测其致病性和临床影响变得困难。
首先，TP53 突变导致 p53 的肿瘤抑制功能丧失（功能丧失，LOF），这足以在人类和小鼠中引发肿瘤发生。在某些情况下，次级改变，如基因组不稳定（染色体数目异常），可导致错义突变蛋白的积累，这些蛋白可能获得新形态的（功能获得，GOF）特性，促进肿瘤生长。理解不同突变体的功能影响对于个体化治疗和遗传咨询至关重要，但许多单一突变的稀有性使得这一工作变得具有挑战性。因此，在同源模型中的高通量筛选，如变异效应的多重检测，是注释 TP53 突变景观的宝贵工具。
一项显著的早期研究在酵母系统中筛选了 2,314 个错义变异的互补 DNA 库，揭示了广泛的功能丧失（LOF），同时也表现出异质性，许多非热点突变体仍保持部分活性。然而，酵母缺乏完整的 p53 调控网络，这促使了在人体细胞中的进一步筛选。虽然基于 cDNA 的人体细胞筛选提供了重要的见解，但也存在一些局限性，包括非生理性表达、缺乏转录后控制和缺少（可变）剪接。这些研究也没有评估 p53 突变对癌症治疗反应的影响，例如辐射、化疗或靶向治疗。
基于 CRISPR 的方法，通过将TP53 变异直接引入内源基因位点，为其功能提供了更生理性和全面的洞察。近期使用 CRISPR 基因编辑或基因编辑引导的原理验证研究显示了前景，但在实现突变景观的全面覆盖方面仍面临挑战。在本研究中，我们通过精确的同源重组修复（HDR）进行 CRISPR–Cas9 介导的基因编辑，称为饱和基因组编辑（SGE），这一技术此前在定义如 BRCA1、BRCA2、CARD11、DDX3X、BAP1 和 VHL 等基因的突变功能影响中发挥了重要作用。利用这一强大技术，我们将 9,225 个变异引入具有野生型（WT）TP53 基因位点的癌细胞中，约涵盖了所有 TP53 癌症突变的 94.5%。与 cDNA 过表达筛选不同，基于 CRISPR 的编辑保留了生理性基因调控，包括内源性启动子、增强子、可变剪接和微小RNA 结合位点。
我们评估了这些变异在通过 Mdm2 抑制剂激活 p53 通路后对增殖适应性的影响，并发现这些结果在其他 p53 刺激因子中也相似，包括辐射、化疗和饥饿。这些适应性效应与患者中的突变频率、进化保守性和结构-功能关系相关。CRISPR 编辑还使得部分失活（pLOF）和剪接突变的准确注释成为可能，展示了通过无义介导衰变（NMD）广泛去除框移或无义转录本。此外，我们还发现了一些之前被认为功能正常的同义和错义突变，这些突变改变了信使 RNA 的剪接，导致完全失活。例如，反复出现的 L137Q 突变导致了一个框内缺失，可以通过剪接转换寡核苷酸（SSOs）靶向，从而为 p53 反应激活策略提供了原理验证。
结果
通过 CRISPR-HDR 介导的TP53 突变的同源模型
为了在受控的同源环境中评估 TP53 变异的功能影响，我们使用了 HCT116 结直肠癌细胞，这些细胞具有典型的 p53 响应且 TP53 基因型为野生型（WT）。通过优化已有的饱和基因组编辑（SGE）技术，我们使两个 TP53 等位基因中的一个失活，以确保基因型与表型之间的明确关联（图 1a，扩展数据图 1a–c 和补充说明1）。为了避免 CRISPR-Cas9 基因编辑过程中 p53的 DNA 损伤反应所带来的混杂效应，我们通过 LoxP 夹心转录终止盒（LoxP-Stop-LoxP, LSL）和选择标记可逆性地沉默了剩余 TP53 副本的表达。为了通过 HDR 进行突变，我们将结果的 HCT116 LSL/Δ 细胞系转染了 CRISPR-Cas9 核酸酶和提供所需突变的供体载体，以进行模板修复。
我们通过引入一组 TP53 变异来验证编辑效果，包括一些已知具有失活（LOF）或部分失活（pLOF）的常见癌症突变、一种无义突变以及野生型（WT）作为参考。我们观察到在 75.9% 的克隆中成功整合了供体序列，在 56.4% 的克隆中成功引入了特定突变（图 1b）。在 Cre 酶切除 LSL 盒后，我们发现在野生型和错义突变体中，p53 蛋白表达水平相当，并且通过 Mdm2 抑制剂 Nutlin-3a (N3a) 进一步增强（图 1c 和扩展数据图 1d,e）。正如预期，N3a 诱导了野生型和 pLOF 突变细胞中的 p21/CDKN1A 表达及典型的 p53 特征标志，但在 LOF 错义或无义突变细胞中则未观察到此效应（图 1c–e 和补充图 1）。实时活细胞成像确认了野生型细胞的生长抑制作用，这一效应在 pLOF 突变体中有所减弱，而在 LOF 突变体中完全消失（图 1f,g 和扩展数据图 1f,g）。单细胞 RNA 测序（RNA-seq）进一步确认了 LOF 效应，并揭示了最小的克隆变异性。
值得注意的是，在这些条件下，我们未观察到任何错义变异的 GOF 效应。错义变异，特别是 R175H 的 GOF 效应，已被广泛记录为促进转移的作用，并依赖于二次变异，这些变异通过稳定突变的 p53 蛋白来发挥作用，因为在非转化细胞中突变的 p53 蛋白本身是非常不稳定的。我们在工程化的 HCT116 细胞中并未观察到这种持续的稳定化，且突变的 p53 水平与亲本 HCT116 及其他非转化细胞类型中的野生型水平均相似（图 1c 和扩展数据图 1h）。N3a 诱导的稳定化水平明显低于自然 TP53 突变肿瘤细胞中的水平（扩展数据图 1i,j），且不足以驱动细胞迁移（扩展数据图 3a–c）。然而，体内连续传代实验显示突变 p53 蛋白水平逐渐上升（扩展数据图 3d,e），并且与 R175H 依赖的迁移、侵袭和肝脏转移的增加相吻合，这些变化在皮下异种移植模型中得到了体现。
总之，HCT116 细胞中的有害TP53 突变立即导致 LOF 效应，在 p53 激活条件下增加了增殖和生存（图 1 和扩展数据图 1 和 2）。相反，R175H 等潜在的 GOF 效应仅在长期体内传代后显现，促进了迁移、侵袭和转移，而未影响增殖适应性（扩展数据图 3）。因此，在诱变后不久，特别是在 N3a 激活 p53 的条件下，测量增殖适应性能够有效捕捉 LOF 效应，同时最小化 GOF 效应的影响。
R175 突变扫描显示变异的功能多样性
利用 HCT116 LSL/Δ 细胞的可编辑性，我们对癌症中最常见的 p53 突变位点——R175 编码子进行了突变扫描。我们构建了一个包含 27 种不同变异的文库，包括错义替代、缺失/插入、无义突变和同义/同义突变。我们将 TP53 定向CRISPR-Cas9 核酸酶与 R175 变异文库共同转染入HCT116 LSL/Δ 细胞，确保每个变异的独立编辑细胞平均覆盖度至少为 1,000（图 2a）。通过靶向扩增子测序验证了编辑结果，确认在生物学重复中，供体质粒中的变异分布与编辑后细胞文库中的变异分布一致，即使在 Cre 诱导重组以激活 TP53 变异表达后也是如此（图 2b–d 和补充表 1）。在未处理的情况下，Cre 重组细胞文库中的变异分布保持稳定 8 周，仅有少量同义变异被耗减（图 2e）。
p53 DBD 的深度突变扫描
我们将筛选扩展到一个包含 9,225 个变异的全面文库，覆盖了 p53 DBD 从外显子 5 到 8（氨基酸 126 到 307），涵盖了大约94.5% 的所有癌症相关错义突变（图 4a 和补充表 2）。该文库包括所有单核苷酸替换（最常见的 TP53 突变类型），以及其他错义、无义和同义变异，这些变异需要进行两核苷酸或三核苷酸的变化、单核苷酸插入和 1-3 个碱基对（bp）缺失。
为克服测序的限制，我们将文库分为四个子文库，每个子文库覆盖一个单独的外显子及其相邻的内含子序列，采用了先前发布的方法。我们将 TP53 靶向的 Cas9 与每个子文库共同转染入 HCT116 LSL/Δ 细胞，随后通过筛选和 Cre 诱导激活突变表达。在用 N3a 或二甲基亚砜（DMSO，作为溶剂对照）处理细胞 8 天后，我们提取了基因组 DNA，通过 PCR 扩增编辑过的外显子，并通过下一代测序（NGS）分析变异频率（扩展数据图 1a 和补充表 2）。我们在三个生物学重复中，确保每个变异至少有 500 个独立编辑的细胞覆盖。对照突变，包括无义（LOF）和同义（WT-like）变异，未显示出显著的丰度差异，确认了高效的供体文库导入，并未出现 TP53相关的偏倚。
结论
总之，使用 CRISPR-HDR 对TP53 进行的深度突变扫描（DMS）提供了 TP53 变异的全面功能注释，能够识别之前通过 cDNA 基于筛查错过的微小 LOF 变异。该研究还突出了可通过药理学拯救的温度敏感变异，以及可能通过反义寡核苷酸（SSOs）修正的剪接变异。重要的是，我们未发现错义突变相较于无效突变具有适应性优势，进一步证明了 GOF 效应需要二次变化。本研究显著提升了 TP53 突变数据库的转化价值，改善了临床变异解读，有助于遗传咨询和个性化癌症治疗。
