前庭导水管扩大（enlarged vestibular aqueduct，EVA）（OMIM：600791）是感音神经性听力损失（sensorineural hearing loss，SNHL）儿童中最为常见的内耳畸形之一。EVA可出现在常染色体隐性遗传性耳聋4型（autosomal recessive deafness 4，DFNB4）中或Pendred综合征等复杂综合征中，与DFNB4和Pendred综合征相关的听力损失表现为语前或语后发病，呈波动性或渐进性，在不同患者中听力损失的严重程度差异大。
DFNB4和Pendred综合征都是由SLC26A4基因的双等位基因致病性变异引起的常染色体隐性遗传性疾病。有报道称FOXI1和KCNJ10基因也与EVA有关，但一些研究对此提出了质疑。此外，Pendred综合征中SLC26A4和EPHA2的双基因遗传模式已在两个日本EVA家族中得到证实。SLC26A4的致病性变异是全世界遗传性耳聋的最常见原因之一。在中国，SLC26A4是耳聋人群中第二常见的致病基因，能够诊断13%-22%由遗传因素致聋的病人。
拷贝数变异（copy number variation，CNV）通常是指长度超过1kb的基因组片段拷贝数的增加或减少，这是导致人类疾病的重要因素之一。有研究表明，CNV是非综合征性听力损失的常见原因。到目前为止，已经报道了SLC26A4基因几种类型的CNV，包括外显子1-2、外显子1-3、外显子4-6、外显子5-6、外显子7、外显子8和外显子11-18的缺失。该团队前期结果已经证明，高达95%的中国EVA患者可以通过对SLC26A4基因的外显子和侧翼区域进行测序而得到诊断。但是，仍有一些EVA患者在基因检测后无法诊断，这对遗传咨询来说是一个巨大的挑战。
本研究前期基于多重PCR及高通量测序开发了一种针对SLC26A4基因外显子和侧翼区域来进行检测的方法，对于仍未能明确分子诊断的患者（携带一个SLC26A4致病变异的M1和不携带任何致病变异的M0），该团队设计了针对性的梯级检测策略，包括基于多重PCR和二代测序数据的拷贝数变异分析、单分子实时（single-molecule real-time，SMRT）测序、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。
本研究共纳入13例未确诊的EVA先证者，其中9个患者为M1，4个患者为M0。所有先证者均表现为双侧感音神经性听力损失，发病年龄从0至15岁不等，严重程度分为重度和极重度，其中，5例患者的听力损失表现为稳定性，7例患者呈渐进性，1例患者呈波动性（表1）。
研究团队根据13例未确诊的EVA先证者的NGS结果，对SLC26A4基因进行了CNV分析，其中7例患者在SLC26A4基因的外显子区域存在杂合缺失（表2）。7个患者中，有1个患者为纯合的外显子5-6的缺失，6个患者携带杂合外显子缺失，与之前检测到SNV组成复合杂合，这7例都得到了明确诊断。
为了确定SLC26A4基因中上述外显子缺失的断点位置，团队设计了引物并进行了长片段PCR。经Sanger测序和进一步的SMRT测序验证揭示了外显子1-3的长度及断点（7666bp，chr7：107300016-107307681，GRCh37）、外显子5-6长度及断点（1845bp，chr7：107314217-107316062）和外显子9-10长度及断点（4979bp，chr7：107329303-107334282）（图2）。
为了确定剩余6名未诊断患者的潜在遗传病因，团队对整个SLC26A4基因进行了SMRT测序，以检测结构变异和深度内含子变异。在2名患者中发现了深度内含子变异（NM_000441.2：c.304+941C>T），并通过家系成员的Sanger测序得到证实。因此，两名患者由深度内含子变异和先前检测到的SNV组成复合杂合而得到诊断。为了验证变异c.304+941C>T并研究其对听力损失人群队列的贡献，团队在包含20666例听力损失患者的中国耳聋遗传联盟（China Deafness Genetics Consortium，CDGC）队列中使用全基因组测序数据筛选了该变异，共发现5例EVA患者携带c.304+941C>T和其他已知的SLC26A4致病性变异，包括c.919-2A>G、c.281C>T和c.1226G>A，占CDGC队列的0.24‰。
为了确定深度内含子变异c.304+941C>T是否影响剪切，团队从正常对照和携带c.304+941C>T杂合变异个体的外周血中分离PBMC，提取RNA并进行反转录和PCR。凝胶电泳显示，与正常对照相比，杂合变异个体表现出两个条带：一个对应于野生型cDNA，另一个对应于突变型cDNA。突变型cDNA的Sanger测序显示，深度内含子变异c.304+941C>T在SLC26A4外显子3和4之间产生了一个新的剪接位点，导致部分AluSz26元件（126bp）的外显子化（图4）。
剩余4名未得到诊断的患者，团队继续采用WES和WGS在SLC26A4基因的调控区域或已知与EVA相关的其他基因（例如，FOXI1、KCNJ10和EPHA2）中寻找致病性变异。然而，四名患者均未在SLC26A4基因的调控区域或其他EVA相关基因中发现任何致病性变异。
综上，在这项研究中，研究团队对13名未确诊的EVA患者进行了全面的基因分析。在7例患者中检测到外显子1-3、外显子5-6和外显子9-10的缺失变异，这些变异通过长片段PCR和Sanger测序得到验证。此外，SMRT测序在2例患者中检测到影响剪切的深度内含子变异c.304+941C>T而得到诊断。因此，对于多重PCR结合NGS后未诊断的EVA患者，该研究采用的梯级检测方法节省了分析复杂WGS数据的时间，减轻了患者的经济负担，提高了EVA的诊断率。新变异的鉴定，包括外显子9-10缺失和c.304+941C>T，扩大了SLC26A4基因的突变谱，这将有助于遗传性耳聋的预防和管理。
