目的：
RORA编码RAR相关的孤儿受体α（RORα），在小脑成熟和功能中起关键作用。在这里，我们报告了最大的RORA相关神经发育障碍（RORA-NDD）个体系列。
方法：
通过国际合作收集了40个携带RORA致病性/可能致病性变异的个体（30个无关个体;来自4个家庭的10个兄弟姐妹）。
结果：
通过基因组/外显子组测序（n=21）、染色体微阵列分析（n=7）或基因面板（n=4）鉴定的33个变异（29个de novo，4个遗传，1个共享），包括移码（n=18/33）、错义（n=9/33）和终止密码子（n=6/33）。发育障碍（n=32/37）、智力障碍（n=22/32）和小脑体征（n=25/34）是最显著的临床特征。将小脑症状分为早发型、晚发型和进行性亚组。小脑发育不全、萎缩或两者兼而有之（n=16/25）在DNA结合域（DBD）中具有错义变异的个体中更常见。癫痫（n=18/38），伴有突出的肌阵挛性癫痫发作类型（n=11/18），分为：i）遗传性全身性癫痫（n=10/18），综合征诊断可识别为6种：癫痫伴眼睑肌阵挛（n=5/6），癫痫伴肌阵挛性缺失（n=1/6）;ii）发育性和癫痫性脑病（n=5/18）;iii）未分类（n=3/18）。报告了一名视力迅速恶化和视锥细胞/视杆细胞营养不良的参与者。
结论：
DBD中的错义变异与更严重的小脑表型相关。RORA-NDD三联征包括发育障碍、小脑特征和一系列肌阵挛性癫痫。
关键词
小脑发育不全;蚓部萎缩;RORA;肌阵挛性癫痫发作;发育障碍
介绍
RORA基因（HGNC：10258）位于人类染色体15q22.2上，编码视黄酸受体相关的孤儿受体α（RORα），该受体属于高度保守的类视黄酸相关孤儿核受体（NR）家族，还包括RORβ（RORB，HGNC：10259）和RORγ（RORC，HGNC：10260）。ROR是多功能转录因子，参与昼夜节律、大脑发育、细胞代谢和免疫的复杂调节。它们共享一个高度保守的结构，该结构由DNA结合结构域（DBD）和配体结合结构域（LBD）组成：DBD与靶基因启动子区域相邻的特定DNA序列（称为ROR反应元件）结合。表征内源性配体仍然是一个持续的挑战，随着合成配体的开发，它可能为各种人类疾病提供新的治疗方法。选择性剪接导致四种RORα亚型（RORα1-4），它们仅在N端不同。在人类中，它们以组织特异性表达模式在各种组织中广泛表达：RORα3仅存在于睾丸中，而RORα1和RORα4主要在小脑中表达，特别是在浦肯野细胞（PCs）以及丘脑核和视网膜神经节细胞中。
GTex门户（https://gtexportal.org/home/）详细报告了人脑中组织特异性RORA基因的表达：主要是小脑，然后是杏仁核、前扣带皮层、尾状核（基底神经节）、皮层、额叶皮层、海马体、下丘脑、伏隔核（基底神经节）、壳核（基底神经节）、脊髓（宫颈c-1）、黑质。
自发突变小鼠交错小鼠（Rorasg/sg）和Rora-/-小鼠揭示了RORα在小脑从胚胎发育到成年的成熟、生理功能和解剖完整性中的作用。斑马鱼幼虫中RORα的破坏同样导致由PC和颗粒细胞丢失引起的小脑发育不全。RORA多态性最初被认为是癫痫的罕见易感因素，最近RORA被确定为自闭症谱系障碍（ASD）的靶基因，确定了受影响个体及其死后小脑和额叶皮层中RORA表达降低。Guissart等人于2018年证明了RORA在孟德尔疾病中的首次直接影响，他们报道了与发育障碍（DD）、智力障碍（ID）、小脑症状、癫痫和ASD显著相关的个体中的16种RORA致病性变异。此外，斑马鱼的实验数据表明，错义变异可能具有不同的单倍体不足或显性毒性作用的致病机制，因为它们分别位于LBD或DBD中。
在这项研究中，我们报告了大量患有RORA-NDD的个体，重点关注小脑和癫痫发作表型。此外，我们报告了一名患有早期和进行性近视并伴有视锥细胞和视杆细胞营养不良的参与者。
结果
临床特征
我们确定了40名未报告的具有致病性和可能致病性RORA变异的个体，其中包括10名受影响的成员，属于4个无关的家庭。纳入时的中位年龄为8岁（Q1：5.0，Q3：22.0–范围：6个月-74岁）。40人中有22人是男性。主要临床数据，以及不可用信息的数量，总结在图1和补充表1中。在以下段落中，分母表示可以评估临床信息的个体数量。
图1
神经发育特征
DD发生在32例（32/37，86.5%）中。在16例（16/40，40%）中观察到正常的运动发育里程碑，中位行走年龄为18个月（Q1：16，Q3：24）。大多数个体出现言语发育迟缓（n=25/33，75.7%），8人表现出言语发育正常（8/33，24.3%）。第一个单词的中位年龄为22个月（Q1：16，Q3：25）。在纳入时，2人无法产生任何单词（n=2/25，8%）。其余个体的语言能力范围从使用几个词（n=4/23，17.4%）到最后一次评估时适龄的言语（n=9/23，39.1%）。8例患有言语构音障碍（n=8/23,34.8%）。在5例（n=5/32，15.6%）中观察到发育停滞。个体11、25、31、32A、32B），以及2个回归（n=2/32,6.2%。个体15、17）。
ID见于22例（22/32,68.8%。由于年龄原因，无法评估7个个体的ID），范围从轻度（n=15/22，68.2%）到中度（5/22，27.7%）和重度（2/22，9.1%）。10例认知功能正常或处于临界水平。13例个体（13/40，32.5%）描述了行为问题，包括焦虑（n=4/13，30.8%）、攻击性（n=5/13，38.5%）、强迫行为（n=3/13，23.1%）、慢性疼痛和非癫痫发作（n=1/13，7.8%）。
个体18患有抑郁症自杀未遂。7名参与者（n=7/30，23.3%）存在注意力缺陷多动障碍（ADHD），7名参与者（n=7/34，20.6%）被诊断出患有ASD或与自闭症一致的特征。9/27人（33.3%）报告了睡眠障碍，主要是夜间醒来，13人未进行评估。未报告睡眠呼吸暂停综合征，也未进行多导睡眠图检查。
神经影像学数据
30例（n=30/40，75%）的脑部MRI结果，17例被认为最初正常（n=17/30，56.7%），并在期刊预证明133中显示轻度非特异性幕上异常（n=3/30，10%）。对于30例中的16例（n=16/30,53.3%），描述了小脑异常。前一项研究的15例（n=15/30，50%）和病例2可以重新评估MRI文件。15例重新评估的MRI中有11例（11/15，73.3%）显示：小脑发育不全主要在蚓部（1/11，9%），孤立性蚓部发育不全（3/11，27.3%），蚓部萎缩（5/11，45.5%）通常主要在蚓部上部，小脑（2/11，18.2%）或蚓部（1/11，9%）发育不全和萎缩的关联。两者都存在于前一项研究的病例2中，该病例在连续的MRI上显示小脑萎缩的显着进展。（图2）。还对个体28进行了连续MRI检查，显示蚓部萎缩的外观。总体而言，在重新解释MRI后，至少有16例（55%）个体存在小脑病变。
图2
癫痫
在这个队列中，一半的个体患有癫痫发作（18/38，47%），个体5在两岁时有一次热性惊厥，并且两个个体的癫痫发作状态未知。癫痫发作的中位年龄为3岁（Q1：1.3;Q3：6.50-范围：6个月–16岁）。癫痫发作在开始时大多是全身性的，如在进化时出现的癫痫发作（14/18;78%），包括肌阵挛性癫痫发作形式（11/18，61%）。癫痫持续状态发生（6/18，33%）且为非惊厥性（n=2）、惊厥性（n=2）、肌阵挛性缺失（n=1）或肌阵挛性（n=1）。17/18（94%）有脑电图数据可用。背景节律（BR）正常（12/15;80%），1例与β混合，2例缓慢，然后5例减慢。记录睡眠时，存在生理睡眠特征（11/12，92%;个体10未知）。发作间期阵发性放电（14/17，82%）为全身性（6/17，35%）、全身性和局灶性/多灶性（5/17，29%）或局灶性/多灶性（3/17，18%）。还评估了光敏性（5/13;38%）和闭眼敏感性（ecS）4/13,30%）。根据国际抗癫痫联盟（ILAE）的分类，癫痫可分为三组：发育性和癫痫性脑病（DEE，n=5）、遗传性全身性癫痫（GGE，n=10）和未分类（n=3）（表S2）。在DEE组中，2例（个体9和个体17）诊断为婴儿癫痫痉挛综合征（IESS），分别在6个月和7个月时发病，在个体17之前出现局灶性和全身性运动性癫痫发作。3人患有肌阵挛性癫痫，2人在6至9个月之间开始，2人在3岁时出现肌阵挛和/或失张力或肌阵挛-失张力发作。
1例（个体3）诊断为癫痫伴肌阵挛失张力发作（EMAtS，以前称为Doose综合征），个体10被怀疑，但数据令人恐惧。GGE组的癫痫发作类型包括i）失神眼睑肌阵挛（n=5），4例合并肢体肌阵挛（发病时间在1岁至10个月和9岁零4个月之间），导致诊断为典型癫痫伴眼睑肌阵挛（EEM，以前称为Jeavons综合征）个体18例和EEM样综合征4例;ii）个体27岁时肌阵挛失神症，被诊断为肌阵挛性失神症（EMA），iii）3岁和4.5岁发病的肌阵挛发作（n=2），以及iv）全身强直阵挛发作（n=2），分别在5岁和16岁发病。在这些个体中，无法确定特定的癫痫综合征。在个体中，12次3Hz的缺席时间非常短。最初怀疑儿童失神癫痫见于20个体，但发病年龄小于4岁，青少年期癫痫发作控制不完全。此外，据报道，闪烁的光线触发了缺失，还存在光敏性和ecS。个体4伴强直阵挛性癫痫发作的综合征诊断可以讨论为记录了单个右额中央癫痫发作，但在局灶性癫痫的进化中没有其他论点。未分类组（n=3）的共同点是运动（局灶性和/或双侧）以及最终意识受损和肌阵挛性癫痫发作类型的复杂关联，从3到7岁之间开始。有趣的是，我们报告了前一项研究中病例6的随访情况：肌阵挛发生在初始多灶性癫痫发作后的演变中。非癫痫发作组的脑电图在可用时（7/19;37%），正常（3/7），显示减慢（2/7）或发作间期放电（2/7）。
癫痫发作/发育结果和抗癫痫药物（ASM）
预先存在的DD仅在DEE-IESS个体中严重，至少在个体17中记录了消退。该类别中的所有个体都与未分类组的个体一样具有药物耐药性，但在后者中，神经发育特征不太严重，有轻度（n=2）或中度（n=1）延迟，没有消退。在GGE组中，罕见的全身强直阵挛发作出现在5例个体中。癫痫发作结局是可变的：与之前研究的更新病例13一样，3人没有癫痫发作，最后一次评估时的随访时间为6个月至3年。在其他6例中，使用了1到4例合适的ASM，其中20例仍在接受三联疗法。有趣的是，3例在丙戊酸或乙琥胺治疗下无原发性癫痫发作，然后复发。进一步的记录并不总是令人满意，但癫痫发作频率似乎有所改善。个体1仍然耐药，癫痫相关因素可能在报告的学习困难中发挥作用。GGE组中预先存在的发育特征被限定为临界型（n=2）或轻度DD（n=4），并且3个未知。报告发育停滞的独特病例与癫痫因素无关，因为他在5至7年之间只有很少的强直阵挛发作，然后在丙戊酸单药治疗下无癫痫发作，最后一次评估随访3年。他患有中度DD。最常用的药物是：丙戊酸（n=9）、左乙拉西坦（n=5）、乙琥胺（n=4），其次是拉莫三嗪（n=3）、苯二氮卓类（n=3）、托吡酯（n=2）和拉考沙胺（n=2）。使用了其他ASMs，主要在DEE或未分类组中：唑尼沙胺、大麻二酚和甲泼尼龙。有趣的是，奥卡西平引发了癫痫发作加重（个体26）。生酮或改良的阿特金斯饮食从3人开始，在2人（个体3和26）中被认为有帮助，2人使用迷走神经刺激器。
眼科发现
除了已经指定的神经性眼球运动障碍外，还有12人患有近视、远视或斜视。个体16是一名24岁的女性，眼科表现最严重，包括早期和进行性近视，以及视锥细胞和视杆细胞营养不良（图3）。她从3岁起就戴着高度近视（-10D）眼镜。在4年的时间里，她的视力从20岁开始从4/10下降到1/20。黄斑看起来像一个樱桃红色的斑点，在眼底周围呈灰色（图3，a，a'），黄斑的自发荧光较低（图3，b，b'）。椭球区在中央凹区域（图3，c，c'）中也被破坏，在OCT的周边视网膜中也被破坏（图3，d，d'）。周边视野收缩（图3，e，e'），与中央暗点相关（图3，f，f'）。视网膜电图低于正常，多灶性视网膜电图处有局灶性中央损伤（图3，g，g'）。
图3
遗传学发现
在这个由40个个体组成的系列中，我们确定了33个迄今未报道的RORA变异（图4和补充表2。在29个个体中，该变异发生或被推定为新发变异（29/40，72.5%），在10个个体中遗传（10/40，25%）显示不完全外显（10个父母中有9个是致病性变异的健康杂合子），1个未知（1/40，2.5%）。
图4
大多数变异沿mRNA序列广泛分布并导致移码（18/33，54.5%）。它们是具体的缺失（14/18，77.7%）和移码插入（4/18;22.3%）。9个变异是错义（9/33，27.3%），5个影响DBD，2个影响LBD，1个位于编码DBD的序列之前，1个位于LBD之后。6个变异是无义的（6/33，18.2%），1个发生在DBD中，4个发生在DBD和LBD之间的区域，1个发生在对应于蛋白质C端结构域的最后一个外显子中。
一个变异c.499C>T(p.Gln167Ter)在两个无关的个体中反复出现（4，30）。四个变异，错义c.274G>A(p.Gly92Ser)，微缺失arr[hg19]15q22.2(60,886,678_61,161,374)x1和arr[hg19]15q22,2（60,768,415_60,956,191）x1，以及无义c.919G>T(p.Glu307Ter），存在于两个或三个兄弟姐妹（家庭21、32、33、34）中，并且在所有情况下都遗传自母亲。在家庭33中，该变异在母亲中被证明是新发的，而在其他家庭中则无法评估。在家庭34中，母亲也受到影响，在家庭21、32和33中，母亲不受影响。
报道了4条染色体缺失，包括RORA基因。arr[hg19]15q21.3q22.31（54,879,765_64,973,929）x1涉及63个编码基因的缺失，其中23个OMIM基因与表型相关。arr[hg19]15q21.2q22.2（52,340,221_62,790,591）x1涉及51个编码基因，其中22个OMIM基因。arr[hg19]15q21.3q22.2（53,313,391_63,042,697）x1缺失了45个编码基因，其中17个OMIM基因。arr[hg19]15q21.3q22.2（55,083,180_62,687,339）x1涉及41个编码基因，其中18个OMIM基因。参与缺失的所有其他OMIM基因被认为与表型表现无关。这9个错义变异特别引起了我们的注意，因为它们主要位于蛋白质的功能域中。特别令人感兴趣的是DBD的区域，范围为90到100个氨基酸，该区域受到9个错义变异中的3个的影响。之前研究的三个错义变异也影响了这个区域。值得注意的是，我们在一个无关的个体（22）中发现了与先前报道的相同的错义变异p.Gly92Ala。
根据分离分析、次要等位基因频率（MAF）和预测性计算机分析，变异分类如下：23个致病性，10个可能致病性。
讨论
越来越多的知识表明，RORA基因对认知和小脑功能特别重要。第一项结合临床、遗传和功能实验数据的研究表明，错义变异根据它们在结合域中的位置，存在双重病理效应。在本研究中，我们显着扩展了RORA-NDD病例系列，报告了40个未发表的个体，其中包含33个以前未描述的致病性和可能的致病性变异。我们还报告了对3名既往报道个体的随访情况。这使我们能够更深入地研究与RORA变异相关的表型。
与第一项研究一致，我们确认超过一半的RORA-NDD病例是由移码变异引起的。几乎所有错义变异都会影响功能域，九分之七位于DBD内部或略微上游（图4），并且在统计学上与更严重的小脑表型相关。另一方面，在具有无义或移码变异的个体中也观察到明显的小脑表型，并且9个变异是从未受影响的父母那里遗传的，显示出不完全外显率。
先前报道的错义变异p.Gly92Ala也在本系列中被检测到。致病性变异的65岁个体杂合子（个体22）显示小脑综合征，伴有缓慢进展的共济失调、小脑和明显的上蚓部萎缩。他与Guissart等人（病例2）报告的变异p.Gly92Ala的第一个受影响个体没有关系，我们为他们提供后续MRI数据。对这些图像的分析表明，除了先天性发育不全外，还可能发生严重的进行性小脑萎缩。此外，我们观察到位于LBD中的两个错义变异（p.Lys339Thr和p.Val379Gly）与不太严重的小脑表型相关。DBD中的错义变异与更严重的小脑体征之间的统计相关性证明了显着的基因型-表型相关性。
共济失调和严重小脑萎缩已在Staggerer小鼠的自然品系和RORA无效小鼠模型中得到充分评估。我们的临床观察反映了这些实验结果，表明在出生后的头几个月或达到步行里程碑后出现早发性小脑体征。相比之下，5人可能致残性RORA相关的小脑疾病随着年龄的增长而进展，6人出现成人发病的小脑体征。有趣的是，在杂合Staggerer（Rora+/sg）模型中，据报道，随着年龄的增长，PC和颗粒细胞的加速丢失会出现。这一观察结果以及我们的临床发现表明，RORα可能在典型成熟之后提供神经保护，并且在成年后对于突触重塑和维持有效的小脑网络仍然至关重要。
这项研究发现，几乎一半的RORA-NDD个体（18/38;47.4%）患有癫痫，这比第一项研究（11/16;69%）要少一些。核心组呈现严重程度不一的GGE，从无癫痫发作到耐药不等。有趣的是，RORB（属于ROR家族的另一个基因）中的杂合变异已被确定为导致GGE伴轻度至中度ID。虽然失神发作是RORB相关疾病的标志，但肌阵挛性癫痫发作在RORA-NDD中更为普遍（61%），最常见的综合征诊断是EEM或EEM样综合征。这两种情况都包括一部分DEE患者，其特征是多重耐药性癫痫发作类型。关于传出小脑通路在促进或抑制癫痫发作中的作用的实验数据产生了相互矛盾的结果。正在讨论三个主要的电生理假说：i）PC丢失导致小脑丘脑-皮质通路的去抑制;ii）齿状核中的神经元细胞丢失导致皮质投射功能失调;iii）感觉运动皮层中GABA浓度或GABA能突触的降低。最近一项使用阳极小脑经颅直流电刺激的电生理学研究进一步支持了小脑参与皮质肌阵挛的病理生理学。进一步分析RORA癫痫发作类型的电生理方面是因为它们随年龄的变化，以验证RORA是否绝对是导致EMA的基因，这将是一件有趣的事情。
在这个系列中，ASD的发生率（7/34;20.6%）比前一个（5/12;42%）要低得多。尽管如此，它仍然是RORA-NDD的一个特点。事实上，完整的小脑-皮层连接不仅支持运动功能，而且还在高级认知和情绪过程中发挥作用。这些子回路的改变可能有助于RORA相关疾病的认知和行为表型。在我们系列中32.5%中发现的行为问题可以代表这一贡献。小脑在ASD中的病理生理学贡献越来越得到认可。RORα1主要在PC中表达，已被验证为至少六个ASD相关基因的转录调节因子：A2BP1（HGNC：18222）、CYP19A1（HGNC：2594）、HSD17B10（HGNC：4800）、ITPR1（HGNC：6180）、NLGN1（HGNC：14291）和NTRK2（HGNC：8032）。此外，作为一种性别敏感基因，RORA被认为可以解释ASD中男性的优势。与RORα和RORγ的先天或合成激动剂在代谢疾病、免疫或炎症中的治疗效果的广泛研究相比，与RORA相关的药理学试验仍然很少见。尽管如此，最近对维生素A缺乏小鼠的一项研究表明，补充维生素A后运动协调性显着改善，这归因于RORA的上调。
RORA也被鉴定为昼夜节律基因。虽然这项研究并没有特别关注评估睡眠-觉醒节律障碍，但在我们的系列研究中，有33%报告了记忆性睡眠异常。在涉及这些个体的未来研究中，应优先考虑睡眠障碍的调查，这可能会导致治疗干预，例如针对RORA相关睡眠问题的褪黑激素靶向治疗。
最后，我们报告了一个独特的病例，即在21岁时诊断出与视网膜变性相关的RORA框内缺失，当时视力开始恶化。由230个基因组成的视网膜病变基因面板和外显子组测序分析未显示任何其他致病性变异。RORA与RORB一起，关键参与光感受器成熟。此外，RORA已被证明是视网膜多个稳态通路的关键调节因子，并且与参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的多个基因有关。最近的一项基因治疗研究使用AAV5-hRORA作为Abca4-/-敲除小鼠模型中的修饰基因治疗黄斑变性，显示出有希望的疗效，因此在疾病早期或中期接受治疗的动物中，视网膜功能和分子结局得到显著改善。
对RORA-NDD个体进行额外的眼底评估很重要，以确认RORA在人类光感受器功能障碍中的致病作用，因为拯救基因疗法可能在下一个将来可用。
结论
RORA-NDD的特征是三个主要特征：（i）发育障碍，（ii）明显的小脑表型伴小脑发育不全/萎缩或两者兼而有之，通常主要发生在蚓部，以及（iii）由各种肌阵挛性癫痫发作组成的癫痫。更严重的RORA相关小脑表现是由专门位于DBD中的错义变异引起的。发病年龄差异很大，从婴儿早期到5十岁不等，一部分个体会进展。仔细的神经系统随访至关重要，当临床小脑体征出现或进展时，应考虑重复影像学检查。
我们建议RORA作为EEM基因;为了证实这一假设，未来需要对癫痫发作类型的电生理方面及其随年龄的演变进行详细分析。对RORA功能障碍的更深入理解可能为针对运动控制、认知、行为、睡眠问题和视网膜功能的新治疗性方法铺平道路。
