我们预测人类基因组中任意遗传变异的表型后果的能力仍然较差。这一问题体现在“可干预”基因中发现的大量意义未明变异（VUS）上，所谓“可干预”基因是指通过确定致病性变异能够改变临床管理的基因。例如，破坏BRCA1基因的种系杂合变异显著增加了早发乳腺癌和卵巢癌的风险，这些变异是可干预的，因为更频繁的筛查或预防性手术可以改善预后。临床测序可以识别特定变异作为风险标志。然而，截至2018年1月，大多数BRCA1单核苷酸变异（SNVs）被归类为VUS。VUS通常表现为罕见的错义SNV，但也包括可能影响信使RNA（mRNA）水平的变异。进一步说明与VUS相关的挑战的是，存在数百个BRCA1 SNV的解释存在相互冲突的情况。
解决意义未明变异（VUS）有两种主要方法。第一种方法是数据共享，依赖于这样的假设：随着更多个体对BRCA1基因进行测序，反复观察到某一变异在已患癌症或未患癌症的个体中出现，将有助于该变异的解读。然而，考虑到BRCA1中大多数潜在变异非常罕见且该基因的表型外显率不完全，因此尚不清楚是否能够对足够多的个体进行测序，从而准确量化每个可能变异的癌症风险。
第二种方法是功能评估，这推动了多种BRCA1的体外检测方法的发展。由于BRCA1的同源重组修复（HDR）功能对肿瘤抑制至关重要，一种常用的检测方法是评估BRCA1变异是否能恢复HDR的完整性。其他BRCA1检测方法评估胚胎干细胞的存活率、转录激活、药物敏感性、蛋白质间相互作用或剪接功能。基于保守性等特征的计算预测可以提供一些信息，但在缺乏遗传或实验数据的情况下，预测的准确性不足以被单独使用。
BRCA1变异的实验评估在多个方面受到限制。首先，这些评估通常是事后进行的，且未能跟上VUS发现的步伐。其次，作为cDNA转基因表达的变异通常被移除出其基因组上下文，这类检测无法评估对剪接或转录本稳定性的影响，并且可能产生过表达的噪声。基因组编辑提供了一种潜在的解决方案，可以克服这些挑战，但目前尚未应用于对BRCA1或其他与癌症易感性相关的基因中的VUS进行表征。
在这项研究中，我们旨在应用基因组编辑技术，测量BRCA1关键区域所有可能单核苷酸变异（SNVs）的功能后果，无论这些变异是否曾在人类中被观察到。考虑到BRCA1基因的庞大，我们优先选择了13个外显子，这些外显子编码了RING和BRCT结构域，这些结构域在BRCA1作为肿瘤抑制因子的功能中起着至关重要的作用。除了约400个意义未明变异（VUS）或解释存在冲突的变异外，所有21个被ClinVar认证的专家小组分类为致病性的BRCA1错义SNV都位于这些外显子中，功能实验中显示能够破坏BRCA1功能的错义和剪接变异也位于这些外显子内（ClinVar是一个广泛使用的临床变异解释数据库，由临床检测实验室提交）。在每个实验中，我们对单个外显子进行饱和基因组编辑（SGE），在该过程中同时引入所有可能的SNV，并同时进行检测。我们使用SGE测量了3,893个SNV的功能效应，涵盖了目标外显子中96.5%的所有可能SNV。这些评分呈双峰分布，并几乎与基于专家评估的致病性判断完全一致。我们预测，基于功能分类的结果将具有及时的临床应用价值，并且将这一方法扩展到其他基因，将大大增强遗传检测的实用性。
结果
许多与同源重组修复（HDR）通路相关的基因，包括与遗传性癌症易感性相关的基因，如BRCA1、BRCA2、PALB2和BARD1，在基因捕获筛选中被最近鉴定为在人类单倍体细胞系HAP1中是必需的（图1a）。为了验证这一发现，我们设计了引导RNA（gRNA）靶向这些基因的外显子，并在共表达Cas9和嘌呤霉素抗性盒的质粒转染后，评估了HAP1细胞的活性（图1b）。通过光学显微镜观察到显著的细胞死亡，基于荧光的存活检测实验表明，靶向这些基因中的任何一个都会显著降低HAP1细胞的存活率，且在一周内效果明显（扩展数据图1）。对BRCA1靶向细胞编辑位点的深度测序确认，细胞死亡是由于突变引起的，因为我们观察到在选择反向框移的插入缺失（indel）时，存在对未编辑位点和某些框内插入缺失的广泛选择。总体而言，这些结果确认了HDR通路组分在人类HAP1细胞中的必需性，并确立了靶向测序作为区分功能性与非功能性BRCA1变异的策略，适用于编辑后的HAP1细胞群体。
接下来，我们设计并优化了饱和基因组编辑（SGE）实验（图1b）。我们选择聚焦于BRCA1的13个外显子，这些外显子编码RING（外显子2-5）和BRCT（外显子15-23）结构域，因为这些结构域对该蛋白作为肿瘤抑制因子的功能至关重要，并且包含已知的致病性或良性错义变异，以及约400个有冲突致病性报告的变异（VUS）。
我们旨在计算每个单核苷酸变异（SNV）的功能评分，以准确量化实验中的选择，同时最小化实验偏差。首先，我们计算了SNV在第11天的频率与其在原始质粒库中的频率的log2比值。其次，利用第5天的SNV频率，对编辑率的位点偏差进行了建模，并进行了校正（扩展数据图5）。第三，为了进行外显子之间的比较，我们对功能评分进行了标准化，使得每个实验的同义变异和无义变异的中位数与全局中位数一致。最后，过滤掉了少数无法自信评分的SNV（例如，第5天表现不佳的SNV；扩展数据图6）。总的来说，我们获得了3,893个在这些外显子内或紧邻外显子的SNV的功能评分（图2e，补充表1，https://sge.gs.washington.edu/BRCA1）。这对应于这些区域中所有可能SNV的96.5%。
这些13个BRCA1外显子中的SNV功能评分呈双峰分布（图2g）。所有无义SNV的评分都低于-1.25（N = 138，中位数 = -2.12），而98.7%的同义SNV（距离剪接位点>3 bp）评分高于-1.25（N = 544，中位数 = 0.00）。我们通过拟合一个双成分高斯混合模型，将所有SNV分类为“功能性”、“非功能性”或“中间型”，其中“非功能性”分布的参数基于所有无义SNV，而“功能性”分布的参数基于未在RNA中耗尽的同义SNV（扩展数据图7）。然后，我们使用该模型估计每个SNV评分来自非功能性分布的概率（Pnf）。Pnf < 0.01的SNV被归类为功能性（72.5%）；Pnf > 0.99的SNV被归类为非功能性（21.1%）；Pnf介于0.01和0.99之间的SNV（6.4%）被归类为中间型。
接下来，我们探讨了我们的功能评分与临床变异解释专家意见（如在ClinVar中可得）的符合程度。对于169个在ClinVar中被认定为“致病性”的SNV，其中162个被归类为“非功能性”，2个为“功能性”，其余5个为“中间型”。相比之下，对于22个在ClinVar中被认定为“良性”的SNV，1个被归类为“非功能性”，1个为“中间型”，20个为“功能性”（图3a）。对于那些功能评分与ClinVar解释明显不一致的3个SNV，后文将进一步讨论。ROC曲线显示，当我们将ClinVar中标注为“可能致病”和“可能良性”的变异分别视为致病和良性时，敏感性为96.7%，特异性为98.2%（图3b）。重要的是，我们的检测方法能够准确预测ClinVar的变异解释，无论突变后果如何；对于错义和剪接位点SNV，当这些与无义SNV分开考虑时，敏感性和特异性都很高（扩展数据图7f）。我们发现，在256个VUS中，64个（25.0%）和122个具有冲突解释的SNV中，60个（49.2%）在我们的检测中被归类为非功能性（图3c）。ClinVar中的错义VUS比ClinVar中没有记录的错义SNV更有可能被评为非功能性（25.9% vs. 17.2%，P = 0.002）。除了在很大程度上与已建立的ClinVar注释相符外，我们的评分还为另外3,140个SNV提供了功能分类，其中绝大多数尚未在临床测序中公开报告。在这些SNV中，498个（15.9%）被归类为非功能性。
结论
实现基因组医学的承诺不仅要求我们能够以成本效益高的方式鉴定遗传变异，还需要准确和明确地解释这些变异。目前，变异解释是瓶颈环节。作为一种可能的前进路径，我们展示了饱和基因组编辑是一种可行的策略，用于在临床可干预的基因中功能性地分类成千上万的变异，其中大多数尚未在人类中观察到。随着进一步的扩展，我们预期这一范式将大大提升遗传信息在临床决策中的应用价值。
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