近日武汉大学中南医院在遗传学经典期刊Human Mutation发表重磅研究，阐述PKD1基因转换也是PKD1致病变异类型，填补了该领域的空缺，拓展了游侠的知识边界，第一作者为邱雪萍博士，郑芳教授为通信作者。
多囊肾病（PKD）遗传上具有异质性，具有常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传的模式。常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是最常见的成人遗传性肾病，其特点是逐渐生长的肾囊肿、肾脏体积增大，最终发展为终末期肾病（ESKD）。ADPKD主要由PKD1和PKD2的突变引起，分别约占85%和15%。此外，最近在非典型ADPKD中识别出几个新的致病基因，如DNAJB11和GANAB。此外，与ADPKD样表型重叠的基因数量也在增加，如HNF1B和OFD1。
对ADPKD的遗传分析似乎比其他单基因疾病更具挑战性。首先，PKD1和PKD2是高度变异的基因，PKD1包含46个外显子，编码长度为12912碱基对（NM_001009944.3），跨越约50千碱基的基因组区域。此外，PKD1有六个假基因，序列相似度约为98%。因此，PKD1的大尺寸、高同源性、高复杂性和高GC含量导致在该基因内检测突变的困难。此外，几个没有突变热点的致病基因和重叠的表型使得ADPKD的遗传诊断更加复杂。
为了避免无意中测序PKD1假基因，使用长距离PCR（LR-PCR）扩增来生成特定位点的模板。Rossetti等人使用五个LR-PCR后跟嵌套PCR来筛选PKD1的整个区域，在选定的患者中获得了80%-90%的高诊断率，但这既昂贵又费事。尽管单核苷酸变异（SNVs）和短插入和缺失（indels）是PKD1和PKD2中主要的变异类型，但也有文献报导识别出大的缺失和重复。多重连接探针扩增（MLPA）是检测PKD1和PKD2基因中缺失或重复的有价值技术，特别是在PCR测序结果为阴性的情况下。如今，全外显子测序（WES）已成为同时研究多个基因的强大工具，在成本效益、节省时间和节省劳动力方面具有优势。然而，作为短reads序列（SRS）技术的一员，其固有的缺陷导致对ADPKD的灵敏度和特异性降低。首先，SRS的短reads可能在准确比对到基因组参考序列时带来挑战，使得在同源区域区分真基因和假基因序列变得复杂。此外，由于这些片段的扩增困难，SRS可能无法检测到高GC含量和复杂结构的区域。
快速发展的第三代单分子长reads测序（LRS）可能会克服SRS的一些缺点，因为它在检测基因组重排方面取得了进展，特别是在重复或复杂的基因组区域。此外，LRS使得在不需要PCR扩增的情况下进行靶向文库制备成为可能。在长序列reads（通常为1000碱基对或更长）中，研究人员可以方便地区分真基因与其假基因的序列，发现准确的断点区域等。
在这项研究中，我们使用长reads测序（LRS）报告了一个ADPKD家族中PKD1基因的致病性基因转换，这在全外显子测序（WES）和多重连接探针扩增（MLPA）中被误判为外显子缺失。据我们所知，这是首次通过LRS在PKD1基因的相关区域识别致病性基因转换的报告。
样本信息
在这项研究中，一个ADPKD家族的五名成员被纳入研究（图1(a)，IV-2，III-1，III-3，III-4和II-3）。从先证者那里获取家族史，并绘制了家系图，以记录每个疑似ADPKD表型的患者的资料。先证者通过超声波检查发现双肾有多个肾囊肿，并在24岁时被临床诊断为PKD。另外两名受影响的家庭成员（III-1和III-4）在50岁之前因肾囊肿需要进行肾脏透析治疗。
图1
先证者的家谱和变异分析。(a) 家系图。先证者由箭头指示（IV-2）。两名疑似患者（III-1和III-4）和两名未受影响的个体（II-3和III-3）参加了后续研究。(b) 基于外显子的拷贝数变异（CNV）分析使用WES数据识别了PKD1中第17和18外显子的杂合缺失。(c) 通过Sanger测序识别了PKD1第18外显子的杂合变异。(d) MLPA-P351识别了PKD1第18外显子的杂合缺失，如红色箭头所示。
结果
WES（全外显子组测序）揭示了PKD1基因中的两个疑似致病变异。首先鉴定的变异是一个杂合的单核苷酸变异（SNV），PKD1（NM_001009944.3）：c.7391G>C（p.Arg2464Pro）。这个特定的变异之前没有被报导过，在千人基因组项目和ExAC数据库中都不存在。只有gnomAD数据库报告了这个变异的人口频率为0.000018。随后，根据ACMG/AMP标准指南，这个变异被分类为意义不明的变异（VUS：PM2）。有趣的是，Yu等人也报告了在同一密码子上的另一个错义变异（c.7391G>T [p.Arg2464Leu]），也被归类为VUS。此外，基于外显子的CNV（拷贝数变异）分析鉴定了一个杂合缺失，该缺失跨越PKD1基因的第17和第18外显子（图1(b)），该CNV被分类为致病性（P：PVS1+PM2+PP4）。
由于c.7391G>T杂合变异位于PKD1基因的第18外显子上，因此也检测到了第18外显子的杂合缺失。为了进一步验证，使用了多重连接探针扩增（MLPA）和Sanger测序对LR-PCR产物进行检测。除了c.7391G>C之外，Sanger测序在PKD1基因的第18外显子中鉴定了另外四个杂合变异（c.7278T>C，c.7288C>T，c.7344C>G和c.7365C>T）（图1(c)）。使用P351探针进行的MLPA分析显示PKD1基因的第18外显子存在杂合缺失（图1(d)）。遗憾的是，由于缺乏MLPA探针，无法验证PKD1基因的第17外显子，这是由于其与假基因的高度同源性所致。
显然，PKD1基因的同一区域存在杂合单核苷酸变异（SNV）和杂合缺失是相互矛盾的，因为由于缺失导致的杂合性丧失（LOH）会引起纯合变异。考虑到MLPA产品中的警告说明，我们认为单个外显子的缺失可能会导致由于SNVs的存在而产生假阳性结果；推测PKD1基因第18外显子的缺失可能是一个假阳性发现，需要进一步验证。
为了澄清这个令人困惑的问题，我们对先证者的基因组DNA进行了针对性的长距离PCR扩增（LRS）。结果显示，PKD1基因的第17和第18外显子并没有缺失，而是在第18外显子周围发现了多个低频率的杂合变异（gnomAD_Propmax AF <0.0001），包括c.7209+28C>T（内含子17）、c.7210-16C>T（内含子17）、c.7278T>C（p.Ser2426Ser）、c.7288C>T（p.Arg2430Ter）、c.7344C>G（p.Leu2448Leu）、c.7365C>T（p.Gly2455Gly）和c.7391G>C（p.Arg2464Pro）（图2）。c.7288C>T（p.Arg2430Ter）变异已经在HGMD数据库、ClinVar数据库和多篇文献中被报告为致病变异，根据ACMG/AMP指南被分类为致病性（P: PVS1+PS4+PM2）。
图2
除了c.7391G>C (p.Arg2464Pro)之外，其他五个变异也被评估为意义不明的变异（VUS）。此外，利用LRS的长读长优势，我们发现这些变异以顺式（cis）形式存在于同一等位基因上（图2(a)）。序列比对表明，除了c.7365C>T之外，所有这些变异都可以与PKD1假基因PKD1P1完全匹配（图2(a)），而其两侧序列与PKD1完全相同。因此，我们推测PKD1与假基因之间存在基因转换，最小转换序列为282个碱基对（图2(a)，chr16: 2156497-2156778，从c.7209+28到7391）。
对先证者的RNA样本进行TA克隆测序，确认了PKD1基因的第18外显子存在五个杂合的同源序列变异（PSVs），并且所有这些PSVs都位于同一等位基因上（图3）。此外，突变克隆转换区域外的序列可以与野生型PKD1完全对齐（图3(b)）。家庭成员的DNA样本Sanger测序结果显示，通过LRS检测到的七个PSVs在受影响的个体（III-1、III-4和IV-2）中为杂合型。相比之下，未受影响的个体为野生型的纯合型（II-3和III-3）（图4）。因此，我们确认基因转换是从先证者的母亲那里遗传来的，她被诊断为PKD，并在45岁时接受了肾脏透析治疗。
图3
结论
总之，我们的研究利用LRS揭示了一个由PKD1基因转换引起的PKD家系，这一发现最初被WES和MLPA误判。我们的结果确定了这个家族的遗传病因，并为产前诊断和植入前遗传诊断提供了基础。这个案例进一步强调了通过替代方法验证WES识别的CNVs或结构变异的重要性，特别是在PKD1这样的复杂结构区域，可能需要多种方法。此外，我们建议LRS可能比WES结合MLPA更适合于PKD的遗传筛查，强调了LRS作为临床诊断和研究中有价值的工具的潜力。
