多重连接依赖探针扩增（MLPA）已在BRCA1/BRCA2基因的诊断中应用超过20年，已知涉及BRCA1的缺失/重复占诊断基因突变的相当一部分。我们描述了一例来自100,000基因组计划（100kGP）的家族，该家族具有显著的乳腺癌/卵巢癌家族史，并携带有178 bp的BRCA1缺失。由于其位置，这一缺失对于下一代测序（NGS）基因面板和MLPA检测来说是隐匿的。对变异数据库的进一步分析表明，这一变异是尼泊尔奠基者变异，凸显了疾病单倍型附近的变异可能导致人类基因组变异学会（HGVS）命名法的不一致。
该家系的先证者（现已去世）被诊断为卵巢癌，而她的患病表妹先后被诊断为乳腺癌和卵巢癌。该家族具有尼泊尔血统，且有阳性家族史，上一代中有三名女性被诊断为早发乳腺癌，诊断年龄为41-50岁（在线补充图S1）。之前的遗传检测包括SALSA MLPA Probemix BRCA1-P002-C1（MRC-Holland）和使用Roche 454 GS-FLX平台进行的NGS检测，最小覆盖度为30×。这些检测在2011年进行，未发现任何合理的诊断变异。因此，先证者和她的表妹于2016年中期被招募到100kGP项目中。
100kGP是一个覆盖全英国的研究，旨在展示基因组测序（GS）在多种罕见疾病和癌症患者中的应用价值。使用了TruSeq PCR-free高通量试剂盒，并从EDTA血液管中提取DNA。GS在Illumina HiSeqX平台上进行，采用150 bp双端测序。比对和变异调用使用了North Star Version 4 Workflow（NSV4, V.2.6.53.23）和GRCh38参考基因组。对患病先证者及其受影响的家庭成员进行GS测序，平均覆盖度分别为40×和52×。测序和生物信息学预处理由Genomics England集中进行。主要分析于2019年中期进行，集中于与家族性乳腺癌相关的10个基因（PanelApp V.1.13：ATM、BRCA1、BRCA2、CHEK2、PALB2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53），但未能发现可能的致病变异。
结构变异（SVs）的检测使用了Manta和Canvas算法。在本研究中，结合SV调用结果，通过基于71,408名个体的聚合数据确定的等位基因频率优先考虑SV变异的筛选。测序比对结果使用IGV v2.15.4进行查看。Manta检测到一个位于BRCA1的178 bp缺失（NC_000017.11:g.43099608_43099786del），该缺失在两名受影响个体中共享，但在其他任何100kGP参与者中均未发现。由于缺失的大小，Canvas未能在此位点检测到任何拷贝数变异（CNV），而一个4.2 Mb CanvasREF调用（chr17:41,276,119–45,511,623）覆盖了BRCA1的整个区域。该缺失仅去除了BRCA1外显子7的12 bp，因此不会影响邻近的MLPA探针结合位点（图1）。结合Canvas的正常结果，这也解释了为何该缺失之前未被检测到。对最新版本BRCA1 MLPA面板的探针设计进行回顾表明，这一缺失对于P087和其他新款试剂盒也是隐匿的（Lillit Atanesyan，个人通讯，2024年）。单倍型分析（在线补充表S1，图S2）识别出一个邻近的编码性单核苷酸变异（SNV），NM_005899.5(NBR1):c.1244T>C，p.Met415Thr，该变异在整个100kGP中也仅为该家族特有，且可能作为标记性SNV使用。
为了优化PCR引物设计，我们评估了周围的基因组特征，并将ClinVar的CNV数据轨道加载到我们的UCSC基因组浏览器会话中（https://genome.ucsc.edu/s/AlistairP/BRCA1_del_final）。对该区域ClinVar CNV的回顾发现，2019年至2023年间提交了三种相似的缺失（见表1）。尽管这三种缺失似乎共享相同的远端断点，但近端断点有所不同，且2/3的注释包含了1或52个碱基对的插入序列。通过对这些注释的仔细审查，并结合100kGP的读取比对数据，表明这三条ClinVar条目实际上表示相同的变异。这一解释通过与提交实验室的讨论得到了证实。尽管这三条HGVS注释均正确，但不明确的是T的插入或者与该变异共存的附近变异（即，位于同一疾病单倍型上）是否也被捕获。NM_007294.4:c.536_547+166delinsT注释包括T的插入，但在IGV中显示为相邻的SNV（见图1）。相比之下，c.536_547+209delinsTCACCTTGAAGAATCTTACTTTAAAAAGGGAGCAAAAGAGGCCAGGCATGGT则同时捕获了SNV和一个附近的8个碱基对重复序列。尽管这些信息在设计PCR引物时可能有用，但最近向HGVS委员会提出的建议（https://hgvs-nomenclature.org/stable/consultation/SVD-WG010/）建议，“两个相距少于两个碱基对的变异应描述为一个单一的‘delins’变异”。因此，SV应该拆分成两个变异，即c.[536_547+166delinsT;547+213_547+220dup]。
使用SpliceAI进行的计算机模拟分析预测了外显子跳跃，并且将附近的变异包含在输入的HGVS字符串中对得分的影响有限（表1）。外显子7的跳跃（r.442_547del）将导致移码突变p.(Gln148Aspfs*51)，因此该等位基因可能具有功能性危害。该缺失-插入变异在认证实验室中进行了验证，并被分类为致病性（PVS1和PM2）。
近年来，DNA测序和芯片技术取得了快速进展。然而，对于大小在50–1000 bp范围内的变异，仍然存在盲点，如此处描述的缺失变异。这些变异太大，无法通过小变异调用算法识别（比如GATK），但又太小，无法通过芯片检测到。为了解决这一不足，临床检测实验室通常采用MLPA技术，其中探针对可以根据需要定制，针对约40–50个基因位点进行检测。此处描述的178 bp缺失突显了部分外显子缺失可能无法被检测到，即使MLPA探针位于同一外显子内。使用基因组测序（GS）数据时，需要适当的算法来检测此类大小的缺失。在基因组测序数据生成后，该变异花费了约3.5年的时间才被发现，延长了该家族的诊断历程，并且延误了对高危家族成员进行级联筛查的机会。
临床变异数据库的查询表明，该奠基者缺失变异源自尼泊尔（表1）。尽管在2022年关于尼泊尔人群中奠基者变异的研究中未能识别该缺失变异，然而该研究使用的方法不太可能识别出该缺失变异，并且仍有31个乳腺癌未解病例的家庭可供筛查。我们预期，使用适当的方法学对这些及其他该族裔家庭进行检测，可能会发现更多携带该隐匿性变异的家庭。
通常，如果对同一变异使用不同的注释，可能会错过其与疾病的关联，这会影响变异的优先级排序。在这个特定案例中，我们注意到ClinVar使用的星级评分系统可能导致178 bp缺失变异在某些分析管道中过滤掉。因此，数据库提交者和编辑者在决定是否将邻近的顺式变异纳入HGVS标注时，应该特别注意先前报告的重叠结构变异。相反，使用过时HGVS标注的旧提交记录理应与较新的记录合并。
游侠点评
正如文章中所言，几十bp到300bp左右的缺失与重复是目前基因检测的盲区，如果算法不覆盖这样的变异就会导致漏检，最近游侠开发了基于WES和Panel的SV分析流程，前期测试效果非常不错，像文章中的缺失不会遗漏，如果你有这样的阳性病例欢迎测试。
