为LNP配方做减法：三组份LNP相关研究进展

经典LNP包含四个必要脂质组分：可电离脂、磷脂、胆固醇和PEG脂质。其中，可电离脂的结构、四组份比例配方都受到专利的严格保护。近年来，为了改善LNP的不可避免的肝靶向性或提升递送效率，除了不断筛选新型阳离子脂质，也有对四组分进行优化，如添加第五组份、修饰PEG脂质、抗体偶联等。目前，也有研究人员尝试给LNP做减法来实现组织器官或细胞的精准靶向，但如何在简化组份的同时维持LNP的稳定性和递送效率是一大难点。以下介绍关于三组份LNP配方的相关研究进展：

进展一 iPLX平台：45% LQ-3、53%Chol、2%DMG-PEG2000

2023年10月13日，蓝鹊生物在bioRxiv上在线发表了题为“Dual Ethanolamine Head Groups in Ionizable Lipids Facilitate Phospholipid-free Stable Nanoparticle Formulation for Augmented and Safer mRNA Delivery”的研究成果。团队筛选出含有双乙醇胺头基的可电离脂质LQ-3，并构建全新三组分mRNA递送系统配方iPLX，详见图1。

图1 LQ-3结构及筛选配方理化特性

将LQ-3应用于传统配方比例时，LNP的递送效率与含有单个乙醇胺头基的脂质SM-102相当。但在进一步优化配方时发现，DSPC的引入会降低LQ-3的递送效率和LNP的稳定性，猜测可能是两种头部基团与mRNA相互作用力的差异造成的。此外，研究发现LQ-3和mRNA会形成众多的氢键和范德华力相互作用，无论在酸性或中性条件下都能保护多达95%以上的mRNA，具有超强的吸附mRNA的能力。在mRNA-iPLX的制备过程中，中性pH条件下即可完成脂质和mRNA的混合，避免了传统LNP在pH置换过程中的聚集问题，详见图2。

研发团队以多价新冠mRNA疫苗为例，对LQ-3 iPLX作为疫苗平台的潜力进行评估，LQ-3 iPLX和SM-102 LNP展现出同等的诱导体液免疫和细胞免疫的能力。毒理研究表明LQ-3 iPLX诱导的系统性炎症因子IL-6和TNF-α显著弱于SM-102 LNP，iPLX递送平台有望进一步提高mRNA疫苗的安全性。

图2 mRNA-iPLX与mRNA-LNP结构与形成过程

进展二 3-Comp Lung LNPs：60% 6Ac1-C12、60% DOTAP、1.2% DMG-PEG2000

2024年7月5日，浙江大学药学院刘帅研究员、顾臻教授、平渊教授等在 Nature 子刊 Nature Communications 期刊发表了题为“Reformulating lipid nanoparticles for organ-targeted mRNA accumulation and translation”的研究成果。研究团队设计了一个具有可生物降解酯核（nAcx - Cm）的可电离阳离子脂质库，并对LNP配方进一步优化，发现胆固醇和DSPC并非是不可或缺的组份，去除后不影响纳米颗粒的稳定性。为此，开发了可以将mRNA精准靶向到肺的三组份递送系统3-Comp LNP（6Ac1-C12/DOTAP/PEG-DMG = 60/60/1.2）。

研究证明，这个三组份递送系统同样适用于SM-102、ALC-0315和DLin-MC3-DMA；使用不同的永久辅助脂质，如DOTAP和DDAB，也能保持相同的嗜肺性；相较于四/五组份LNP来说，3-Comp LNP一定程度上规避了mRNA泄露靶向其他组织器官的问题，实现mRNA精准的肺部靶向积累（见图3）。

图3 nAcx-Cm LNPs（三/四/五组份）的体内mRNA递送功效（肺靶向）

进展三 stLNP平台：an ionizable cationic lipid、a targeting lipid、1.5%PEG-DMG

2024年10月10日，中国科学院动物研究所魏妥研究组与北京大学程强课题组合作，在Advanced Materials上发表了题为“Simplified Lipid Nanoparticles for Tissue- And Cell-Targeted mRNA Delivery Facilitate Precision Tumor Therapy in a Lung Metastasis Mouse Model”的研究成果。团队基于此前开发的SORT技术，进一步通过正交实验优化LNP组分，结果发现去除DSPC和胆固醇的三组分LNP（stLNP）在递送效率和器官特异性方面表现更佳。初步确定了目标组织的最佳配方（见图4），包括stLNP-肺（SM102/DOTAP/PEG-DMG = 65.7/32.8/1.5）、stLNP-脾脏（SM102/18PA/PEG-DMG = 73.9/24.6/1.5）和stLNP-肝脏（SM102/胆固醇/PEG-DMG = 65.7/32.8/1.5）。

图4 靶向不同器官的stLNP 处方筛选

研究人员注意到 stLNP-肺部和stLNP-肝脏的静脉给药都会导致一定程度的 mRNA在脾脏中的表达泄漏，特别是以高比例阳离子脂质处方给药时，还会导致意想不到的脱靶效应（图 4）。为了进一步提高mRNA-LNP对组织和细胞的特异性靶向递送，在mRNA骨架中引入特定的miRNA（miR-142ts）靶点的反向互补序列，很好的解决了器官靶向中的表达泄漏问题（图 5）。

图5 评价引入miR-142ts靶点mRNA的表达及分布情况

此外，进一步分析肿瘤细胞和肺部正常组织细胞中miRNA表达丰度差异发现，miR-126在肺内皮细胞和上皮细胞中高表达而在肿瘤细胞中低表达。将miR-142ts和miR-126ts双靶点整合到mRNA骨架中，发现额外的miRNA靶点插入降低了mRNA在肺部正常组织细胞中的表达，但不影响其在肿瘤细胞中的高表达（图 6）。为此，提出了将mRNA精确递送到肺内肿瘤细胞的方法，并将这一方法命名为SELECT（Simplified LNP with Engineered mRNA for Cell-type Targeting）。

图6 miR-126 靶点整合到 miR142ts-Luc mRNA 序列表达情况示意图

传统四组份LNP 中存在未修饰的胆固醇可促进脂蛋白包被，从而增强与肝细胞的相互作用。iPLX作为体液和细胞免疫能力较SM-102更强、安全性更好的递送平台，应用于新冠mRNA疫苗，为此保留胆固醇以靶向肝脏。3-Comp Lung LNPs及 stLNP平台主要期望解决传统LNP肝部靶向偏好的问题，将mRNA LNP技术应用于更多的临床适应症中，为此在配方中去除了胆固醇。

在当前设计用于siRNA或mRNA递送的市售 LNP中，DSPC含量在10% 左右。作为“辅助”脂质，DSPC在核酸封装和颗粒形成中起稳定结构的作用。但iPLX、3-Comp Lung LNPs及 stLNP三个递送平台在配方优化的过程中发现：常用的“辅助”脂质DSPC对mRNA递送和颗粒稳定性都有不利影响，具体的影响因素和相关机制还有待深入研究。

部分研究表明，当使用DSPC时LNP颗粒倾向于形成气泡样结构。因为DSPC形成脂质双层结构的倾向性强烈，在受压或过度储存下会形成气泡，mRNA也会释放到气泡空间中，当可电离脂质通过 pH 降低重新获得其电荷时，mRNA被重新吸收到脂质核心中，详见图7。这种动态现象强调了离子相互作用在维持 LNP 稳定性中的关键作用。气泡结构的产生和融合取决于多种因素，如可电离脂质的种类、pH 4缓冲液的浓度、透析缓冲液的类型及浓度等。此外，气泡的形成方式、结构类型、整体比例都可能是影响LNP最终转染效力的因素。各种因素凸显了LNP结构与功能间的复杂关系，但目前仍难以准确识别气泡结构对纳米颗粒的利弊属性和相关性。

图7 气泡结构的mRNA LNP系统的形成机制

相较于mRNA疫苗方向技术的不断迭代，治疗性 mRNA 药物的进展在一定程度上受到当前靶向/不完整靶向技术的阻碍。应肝外组织器官靶向递送的需求，开发出各种三组份配方，对LNP做减法消除胆固醇和磷脂、保留 LNP 功能。这一进步标志着脂质优化迈出了重大一步，丰富了当前LNP递送系统的多样性并扩大了靶向可能性。显着推动 mRNA 治疗领域的进步，挖掘mRNA LNP技术在治疗多种疾病方面的全部潜力。

参考文献

[1] Lu J, et al. Dual Ethanolamine Head Groups in Ionizable Lipids Facilitate Phospholipid-free Stable Nanoparticle Formulation for Augmented and Safer mRNA Delivery. bioRxiv. 2023 Oct.  DOI:10.1101/2023.10.13.562139.

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