研究结果表明
N1-501具有以下突出优势：
包封工艺简便 具有优异的RNA递送能力 适用范围广，可应用于多种细胞类型和动物模型
可加速从实验室筛选研究到临床前研究的过渡，能有效降低成本，提高转化成功率。研究团队在18种不同细胞系和小鼠模型中评估了该材料的转染性能。实验结果验证，N1-501在多种实验条件下均表现出稳定且卓越的转染效果，这些条件包括：
不同生理缓冲液成分 各种pH环境 (pH 4.0–8.0） 多种孵育温度和时间（0–37 °C, 0–60 min） 培养基类型 血清耐受性
优于行业金标准的体外RNA转染效率
安全有效的实现体内外高效的mRNA转染
N1-501 与其他体外转染试剂不同，它可以同时实现体内体外的转染。研究人员通过尾静脉注射的形式评估了N1-501在体内系统性递送荧光素蛋白mRNA的性能。在给药后 3、6 和 12 小时注射 D-荧光素，并对小鼠进行全身成像以评估各时间点的荧光素酶蛋白表达。结果表明，N1-501给药组在所有时间点均表现出优异的脾脏选择性 (图2A)，总荧光信号在 3 到 12 小时之间逐渐减弱 (图2C)。离体成像进一步证明了 mRNA 递送的器官和组织选择性。荧光信号主要分布在脾脏、肺和肝脏中，其中脾脏的荧光强度比肺和肝脏高出两个数量级，说明N1-501在mRNA递送方面具有显著的脾脏靶向能力 (图2B)。
极其简便的操作使用方法
N1-501可以通过简单的移液枪混合方法包封mRNA（如图 3 所示），也可以使用振荡器辅助混合和包裹。其良好的水溶性特征使整个配制过程能够在水相系统中进行，无需添加任何有机溶剂或缓冲液。将N1-501与稀释后的mRNA在无RNA酶水中混合后，纳米颗粒可通过自组装形成，样品在室温下预孵育 3 分钟后即可用于细胞转染。体内制剂需调至1X PBS浓度再用于动物实验。与移液枪混合法相比，振荡混合法能提供更均一的粒径。两种方法均易于操作，可以在标准的实验室条件下进行。
细胞转染率、mRNA 表达水平和细胞活力是评估 mRNA 转染的三个关键标准。RNA 剂量在不同应用中会根据研究目标和实验设置有很大差异。为了探索安全窗口和功效范围，研究人员在HEK 293T细胞中测试了不同的mRNA和 N1-501 剂量组合，以观察不同剂量对于RNA转染的影响。结果显示，GFP蛋白表达水平（以平均荧光强度，MFI表示）与mRNA剂量呈正相关性（图 4A）。如果mRNA 剂量过高，可通过降低 N1-501/mRNA 比例以平衡功效和安全性。值得注意的是，N1-501在所测试的所有 mRNA 剂量条件下的转染效率均在 96% 以上（图 4B）。这些结果可为研究人员提供参考，以确定特定应用场景中的边界条件和最佳剂量范围。
图4. N1-501 在不同 mRNA 和载体剂量组合下的转染性能和安全性概况。
适用于多种缓冲液和培养基条件，以满足不同的研究需求
生理缓冲液在基因递送中也起着多种作用，比如基因载荷和制剂的储存、配方工艺开发等。具有特定pH 范围的缓冲液对维持基因载荷的稳定性和功能至关重要。它们还会影响可离子化递送材料的电荷，从而影响纳米颗粒的包封效率、粒径、均一性和稳定性。在本作者在配方开发过程中测试了四种常见的生理缓冲液——柠檬酸盐（pH 4.0、5.0和6.0）、醋酸盐（pH 4.0、5.0和6.0）、磷酸盐缓冲盐水 (PBS，pH 7.4) 和 HEPES （pH 8.0）。由N1-501递送的eGFP mRNA在细胞内的表达水平显示出明显的pH 依赖性：在pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液中制备的纳米颗粒产生了最高的MFI，在pH 5.0 和pH 4.0中信号依次减弱 (图5A)；醋酸盐缓冲液显示出类似的趋势。在pH 7.4的PBS和pH 8.0的HEPES缓冲液中的MFI与在水中的表现相近。值得注意的是，转染效率在所有缓冲液和pH条件下无显著性差异（图5B），表明N1-501在各种缓冲体系下具有良好的稳定性和适应性。
N1-501还具有良好的血清耐受性。血清可能会引入RNA酶污染、或与载体竞争细胞表面受体阻止其进入细胞、或影响载体/mRNA复合物的稳定性，从而干扰 mRNA 转染。因此，实验中通常会使用无血清或降血清的培养基（如Opti-MEM）以获得最佳的转染性能。然而，这些条件对于需要维持一定血清浓度的应用和（或）细胞系不适用。本研究中，N1-501 能够在有血清的条件下成功转染细胞，且不同缓冲液体系、pH范围和培养基条件对细胞活性基本没有影响，证明了 N1-501 在各种配制和处理条件下具有良好的安全性。
转染效果稳定且不受孵育时间和温度的影响
纳米颗粒配方的稳定性和可重复性对于mRNA转染实验至关重要。稳定的纳米颗粒能够保持mRNA 的完整性，并能简化制剂的使用和运输。此外，稳定的制剂还可以支持时间密集型任务，例如高通量实验和需要用同一个样品进行多种实验的情况。稳定且一致的配方不仅能保持转染效果，还能提高实验成功率，确保结果的可靠性和可重复性。
结果表明，在0 °C或25 °C 下孵育长达60分钟的N1-501/mRNA复合物作用于细胞后转染效率仍然超过98%（图6B）；样品在37 °C 下孵育一小时后，表达GFP蛋白的细胞比例仍保持在95% 以上。各条件下恒定的高转染效率表明N1-501材料包裹RNA的能力卓越，可以确保纳米颗粒优异的稳定性和重复性，可适应高通量实验、转化研究或其他复杂研究中可能出现的不均一性。
图6. 样品制备后的预孵育时间不影响N1-501的mRNA转染效果
材料稳定，可长期保存，适合长期研究使用
总结
References
Yang, X.; Xiao, J.; Staveness, D.; Zang, X. Efficient MRNA Delivery In Vitro and In Vivo Using a Polycharged Biodegradable Nanomaterial. bioRxiv 2024, 2024.11.05.622171. https://doi.org/10.1101/2024.11.05.622171.
