第一作者：Fabian Kunisch
通讯作者：Andrej Trampuz
通讯单位：明斯特大学
研究速览
多重耐药性铜绿假单胞菌的流行威胁着现有抗生素的疗效，而新抗生素的研发前景有限。裂解性噬菌体，即细菌病毒，为对抗这一威胁提供了一条途径。体外定向进化传统上用于扩大噬菌体宿主范围或增加浮游培养物中的细菌抑制。然而，高达 80% 的人类微生物感染与生物膜相关，而针对增强噬菌体对抗生物膜能力的研究却很少。本研究旨在通过体外生物膜进化实验，同时改善多种噬菌体参数，并利用细菌噬菌体耐药性权衡来优化噬菌体混合物的设计。进化后的噬菌体表现出更广泛的宿主谱、更有效的抗菌作用和更强的抗生物膜性能。
近日，来自明斯特大学的研究人员通过实施针对生物膜细菌的体外定向进化方法，整合了噬菌体宿主光谱、抗菌和抗生物膜能力的综合改进。为了进一步提高进化噬菌体对 MDR 铜绿假单胞菌菌株的疗效，我们设计了一种抗性适应噬菌体混合物。本研究提供了一个噬菌体训练平台，有助于更好地了解细菌噬菌体抗性，并能够识别赋予增强噬菌体功效的不同基因组参数。
研究要点
要点一：内体外进化训练提高了噬菌体的宿主范围、抗菌和抗生物膜性能。 通过针对生物膜细菌进行进化，噬菌体获得了更广的宿主范围，更强的抗菌和抗生物膜活性，例如能够抑制生物膜的热量产生，并降低生物膜细胞计数。
要点二：噬菌体耐药性权衡被用于设计双噬菌体混合物。 通过组合两种噬菌体，可以防止细菌产生双重耐药性，从而提高治疗效率并延长治疗时间。
要点三：进化噬菌体平台有助于更好地理解噬菌体与细菌之间的相互作用。 通过分析进化噬菌体的基因组，研究人员可以识别出赋予噬菌体增强功能的基因组参数，并进一步开发噬菌体疗法。
图文导读
图 1 |抗生物膜进化测定的实验设计。进化试验的实验设置以扩大噬菌体（噬菌体）的宿主范围并提高抗菌和抗生物膜活性。a 在高温和 37°C 下，在胰蛋白酶大豆汤 （TSB） 中与铜绿假单胞菌孵育，在多孔玻璃珠上形成生物膜。在转移到量热安瓿瓶中之前，用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中预先建立的生物膜浸泡洗涤珠子。b 表示一个量热安瓿瓶，其中包含 TSB 中一个铜绿假单胞菌菌株的 24 小时预先建立的生物膜珠和含有四个祖先噬菌体的第 0 轮 （R0） 的噬菌体混合物。在每轮进化过程中，总共使用了 43 个安瓿瓶 （每个菌株 1 个生长对照和 4 个噬菌体混合物稀释液和 3 个无菌对照）。c 记录每个安瓿瓶的产热 （J）在 24 小时内，在每轮结束时，在 24 小时（第 1-15 轮）或 8 小时（第 16-30 轮）时间点确定含噬菌体安瓿相对于生长对照安瓿的热量减少百分比。选择显示热还原等同物高于 75% 的样品（称为活性样品），并与未稀释的噬菌体样品（始终包括在内）一起混合到新的噬菌体混合物中。e 在所有八种细菌菌株中，每轮后未稀释的样品和活性样品被混合在一起，产生噬菌体混合物，作为下一轮的起点，因此被重新添加到预先建立的生物膜珠中。总共进行了 30 轮进化。
图 2. 未进化和进化噬菌体的宿主范围分析。a 基于核心基因 (19,556 个基因中的 3,667 个) 的铜绿假单胞菌菌株集合 (80 个菌株) 的系统发育树，包括四个基因组集群 (集群 1，黑色分支，71.3%；集群 2，蓝色分支，25.0%；集群 3，紫色分支，1.3%；集群 4，绿色分支，2.5%)。根据其耐药谱 (4MRGN，红色文字；3MRGN，蓝色文字；MRGN，多耐药革兰氏阴性) 对每个菌株进行分类。标记有星号的菌株包含在实验进化中。通过点印迹覆盖活性测定未进化 (深灰色) 和进化 (R15，蓝色；R30，绿色) 噬菌体对细菌集合的活性 (热图)。b 每个噬菌体在细菌集合中的相对感染率和绝对感染率。垂直虚线表示至少对一种噬菌体敏感的细菌菌株的百分比 (62.5%)。37.5% (30 个菌株) 的细菌菌株对任何噬菌体都不敏感 (CRS，完全耐药菌株)。c 进化噬菌体感染率增益和损失的表示。感染率增益 (黄色条形) 被定义为进化噬菌体感染细菌菌株的能力，该菌株最初对噬菌体的基因组最近的无进化祖先噬菌体不敏感。当细菌菌株对未进化祖先噬菌体敏感但对相应进化噬菌体具有耐药性时，就会发生感染率下降 (红色条形)。d 进化噬菌体在进化菌株 (ES) 或所有菌株 (AS) 中的累积感染率增益的表示。感染率增益 (黄色条形) 被定义为进化噬菌体感染细菌菌株的能力，该菌株最初对噬菌体的基因组最近的无进化祖先噬菌体不敏感。当细菌菌株对未进化祖先噬菌体敏感但对相应进化噬菌体具有耐药性时，就会发生感染率下降 (红色条形)。
图3 未进化噬菌体和进化噬菌体的抗生物膜和抗菌活性. a qPCR 确定的 24 小时预形成的 Paer09 (包含在进化中) 生物膜未经处理 (GC) 和与噬菌体 FJK (未进化)、FJK.R9-15 (15 轮进化) 和 FJK.R9-30 (30 轮进化) 共孵育 3、6 和 24 小时后的细菌负荷 (CFU/珠)。p 值分别为 0.0365 (6 小时，FJK vs. FJK.R9-15)、0.0010 (6 小时，FJK vs. FJK.R9-30) 和 0.0242 (24 小时，FJK vs. FJK.R9-30)。b 测量 48 小时 Paer09 生物膜与噬菌体 FJK、FJK.R9-15、FJK.R9-30 或未处理 (GC，虚线) 共孵育的热流 (µW) 曲线。垂直虚线表示在每个处理样本中检测到的最小热流 (µW 值在上角)，这与噬菌体对细菌细胞的最强抑制效应相关。p 值为 0.0004 (FJK vs. FJK.R9-15/30)。c、d 分别表示经噬菌体处理的 Paer09 生物膜的热 (J) 曲线以及每个测试条件的计算抑制时间。p 值分别为 0.0014 (FJK vs. FJK.R9-15) 和 0.0085 (FJK vs. FJK.R9-30)。与 Paer57 (包含在进化中) 共孵育的 Paer57 经噬菌体 MK、MK.R57-15、MK.R57-30 或未处理 (GC) 的相同设置。p 值分别为 0.0032 (e，3 小时，MK.R57-15 vs. MK.R57-30)、0.0493 (e，24 小时，MK vs. MK.R57-15)、0.0431 (e，24 小时，MK vs. MK.R57-30)、0.0056 (f，MK vs. MK.R57-15)、0.0053 (f，MK vs. MK.R57-30) 和 <0.0001 (h，MK vs. MK.R57-15/30)。与 Paer36 (未包含在进化中) 共孵育的 Paer36 经噬菌体 MK、MK.R3-15、MK.R3-30 或未处理 (GC) 的相同设置。p 值分别为 0.0067 (i，6 小时，MK.R3-15 vs. MK.R3-30)、0.0182 (j，MK vs. MK.R3-30)、0.0369 (j，MK.R3-15 vs. MK.R3-30)、0.0105 (l，MK vs. MK.R3-30) 和 0.0012 (l，MK.R3-15 vs. MK.R3-30)。
图4 进化噬菌体的基因组示意图 a-c 对于每个噬菌体属，提供了一个祖先噬菌体 (FJK、FIM 或 MK/JS) 的基因组图，并在顶部突出显示了相关功能注释。每个彩色箭头代表一个编码序列，白色编码假蛋白，蓝色 (DNA) 与代谢相关蛋白，绿色病毒蛋白，红色基因组包装或细胞裂解蛋白。进化噬菌体在第 15 和第 30 轮后的基因组变化显示在每个祖先噬菌体基因组下方，删除以 delta 符号表示，并注释了单个单核苷酸多态性 (SNP)。对于 Pakpunavirus 成员，还显示了两种祖先噬菌体的 BLAST 比较。d EPS 去聚合酶 FJK_gp62 的三级结构预测。在红色中，位置 98 上的半胱氨酸残基突出显示，在进化噬菌体中，它被突变成了芳香族氨基酸苯丙氨酸。
图 5. a: 比较了五种噬菌体（FJK, FJK.R9-15, FJK.R9-30, MK, MK.R3-15）在48株 Paer09 菌株上的成菌效率。EOP 定义为噬菌体在噬菌体处理的菌株上的浓度（分子）与未处理的 Paer09 菌株上的浓度（分母）的比值。EOP 高于 10 表示噬菌体效率提高，EOP 为 0.1 到 10 表示效率不变，EOP 为 0.001 到 0.1 表示效率降低。EOP 等于或小于 0.001 表示菌株对噬菌体耐药。括号中列出了与氨基酸变化相关的突变相关蛋白。未标记表示无法识别突变。b: 根据突变蛋白显示突变菌株数量。c: 根据治疗组和突变蛋白显示突变菌株数量。d, e: 在 MOI 为 0.001 的情况下，将浮游细胞 Paer09 与噬菌体 FJK (图d), FJK.R9-15 (图e) 和 FJK.R9-30 (图f) 共培养三天的 OD600 测量结果。细黑线代表每个单独的重复 (n = 8)，粗色线代表平均值。对于 FJK.R9-15/30，完全抑制的重复从平均值计算中排除。g: 将噬菌体 FJK (灰线；图d), FJK.R9-15 (紫线；图e) 和 FJK.R9-30 (黄线；图f) 在三天内与生长控制 (图d) 和阴性对照 (图g) 的共培养曲线的平均值进行比较。噬菌体 FJK.R9-30 (图g) 的 MOI 为 0.0001。
图 6. a: 比较了五种噬菌体（FJK, FJK.R9-15, FJK.R9-30, MK, MK.R3-15）在18株 Paer09 菌株上与噬菌体混合物 (FJK.R9-30 + MK.R3-15) 共培养后的成菌效率。EOP 定义同图5。EOP 高于 10 表示噬菌体效率提高，EOP 为 0.1 到 10 表示效率不变，EOP 为 0.001 到 0.1 表示效率降低。EOP 等于或小于 0.001 表示菌株对噬菌体耐药。括号中列出了与氨基酸变化相关的突变相关蛋白。未标记表示无法识别突变。b: 根据突变蛋白和治疗组显示突变菌株数量。c: 使用 qPCR 确定的 24 小时预先建立的 Paer09 生物膜未经处理 (GC) 或与 FJK.R9-30 或噬菌体混合物共培养 (3, 6 和 24 小时) 后的细菌负荷 (CFU/珠)。p 值为 0.0077 (6 小时，混合物 vs. FJK.R9-30)。d, e: 在共培养 48, 72 和 96 小时后，Paer09 生物膜与 MK.R3-15, FJK.R9-30, 混合物 (单个重复) 或未经处理 (GC，虚线) 的共培养过程中测量的热流量 (μW) 和热量 (J) 曲线。d 图中右上角的热流量最小值。p 值为 0.0404 (FJK.R9-30 vs. 混合物) 和 0.0024 (MK.R3-15 vs. 混合物)。f: 从每个测试条件的热曲线上计算的延迟时间 (h)。p 值为 0.0051 (FJK.R9-30 vs. 混合物) 和 0.0002 (MK.R3-15 vs. 混合物)。g: 在共培养七天 (图g) 和三天 (图h) 后，将浮游细胞 Paer09 与噬菌体混合物 (MOI: 0.001, 图g; MOI: 0.0001, 图h) 的 OD600 测量结果。细线代表每个单独的重复 (n = 8)，粗色线代表平均值，完全抑制的重复从平均值计算中排除。i: 与生长控制 (图d) 和阴性对照 (图g) 的共培养曲线 (图d, e) 的平均值在三天内进行比较。噬菌体混合物 (MOI: 0.0001) 以虚线绿色曲线表示。
结论
原文介绍了一种通过体外定向进化来提高噬菌体对抗铜绿假单胞菌生物膜的能力的方法。研究人员设计了一种噬菌体混合物，并利用细菌对抗噬菌体耐药性的权衡来提高治疗效果。结果显示，经过进化的噬菌体表现出更广的宿主范围、更强的抗菌活性和更好的抗生物膜性能。这种噬菌体混合物可以作为一种新的治疗手段，用于治疗多重耐药细菌感染，并改善临床疗效。
全文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-52595-w
参考文献：Kunisch, F., Campobasso, C., Wagemans, J. et al. Targeting Pseudomonas aeruginosa biofilm with an evolutionary trained bacteriophage cocktail exploiting phage resistance trade-offs. Nat Commun 15, 8572 (2024).
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