第一作者：Zhihui Han
通讯作者：程亮
通讯单位：苏州大学
研究速览
骨髓炎发病率的增加和抗生素滥用导致的耐药细菌的出现对传统治疗方法构成了重大挑战。通过细菌增殖和细胞内感染形成生物膜会使反复和长期感染持续存在。同时，细菌感染引发的免疫反应破坏了内在的骨代谢平衡，导致炎性骨溶解。在此，开发了一种具有多种抗菌能力和骨代谢调节能力的铈-阿仑膦酸钠超分子水凝胶（CAG），以应对骨髓炎的多方面挑战。可注射和自愈CAG对金黄色葡萄球菌（S.A）和大肠杆菌（EcN）的抗菌功效增强，响应ROS微环境，有效破坏生物膜并根除细胞内感染。CAG内的Ce离子破坏了细菌膜并破坏了细菌膜电位，从而阻碍了细菌能量的产生。此外，CAG成功逆转了内毒素诱导的细胞凋亡和成骨细胞的异常成骨分化。RNA测序显示，CAG通过促进钙内流、上调钙信号通路和TGFβ通路以及增强Bmp2/Smad5通路相关蛋白的表达来促进成骨分化。体内实验证明了CAG治疗SA诱导的骨髓炎和改善7天和28天骨髓炎小鼠骨组织生成的疗效。总体而言，本研究提出了一种针对全期细菌感染和恢复骨代谢平衡的综合疗法，突出了一种治疗感染性骨损伤的新方法。
要点分析
要点一：CAG的抗菌、抗生物膜和细胞内细菌清除能力。CAG不仅对游离菌有杀伤作用，还能有效地破坏生物膜，清除细胞内细菌，感染过程中微环境中的ROS显著增强了这一作用，CAG在细菌感染各个阶段的关键作用。
要点二：CAG的抗菌机制。CAG通过干扰细菌的膜电位来抑制ATP的产生和影响细菌呼吸，而来自微环境的ROS增强了这些杀伤作用。
要点三：细胞相容性及CAG调节骨代谢的能力。CAG具有良好的细胞相容性，能有效抑制Bax蛋白的分泌，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。CAG通过增加细胞内钙浓度，逆转LPS对成骨分化的抑制，促进成骨相关蛋白的表达。
要点四：CAG用于体内金黄色葡萄球菌诱导的骨髓炎。注射CAG可以有效地抑制感染在小鼠体内的传播，炎症反应减弱，破骨细胞形成减少，成骨细胞蛋白表达增加。CAG通过抑制细菌向周围组织扩散，减少全身炎症反应，对治疗长期骨髓炎仍然有效。
图文导读
图1：ROS微环境通过调控抗菌和骨代谢增强CAG逆转骨感染的示意图。针对微环境中的ROS，由铈离子和阿仑磷酸钠（CAG）组成的超分子水凝胶（supermolecular hydrogel，CAG）进行大小转化，更好地提高骨感染过程中对游离细菌、生物膜和胞内细菌的抵抗能力，有效减少破骨细胞，同时抑制内毒素诱导的成骨细胞凋亡和成骨分化受损，改善感染诱导的炎症性溶骨，加速骨组织修复。
图2：Ce-阿仑膦酸盐超分子水凝胶的合成与表征。(a)西仑膦酸盐金属有机纳米纤维（CAF）的合成过程示意图。(b)阿仑膦酸钠（Aln）和CAF的XRD结果。(c)阿仑膦酸钠（Aln）和CAF的拉曼光谱。(d) CAF中O1s的XPS光谱。(e)各时间点CAF的大小分布。左上角为相应的TEM图像。比例尺：100nm。(f) pH调节下CAF向CAG过渡的照片。(g) CAG的SEM图像（右）和注射性（左）。(h)旋转流变仪CAG的角频扫描曲线。(i) CAG在相振荡应变作用下的流变力学曲线。振荡应变分别为1%和10%。(j)密度泛函理论（DFT）计算得到CAF的结构和静电势分布。(k) CAG的DFT几何形状。(l) DFT得到的CAF和CAG的结构和跃迁。(m)过氧化氢（HCAG）作用1 h CAG的SEM图像。比尺：100 μm。(n) Ce3d在CAG和HCAG中的XPS光谱。(o) 经过14天CAG和HCAG的相对重量曲线（n=3）。(p)金黄色葡萄球菌（S.A）、大肠杆菌（EcN）、CAF、S.A+CAF和EcN+CAF的Zeta电位（n=3）。
图3：CAG的抗菌、抗生物膜和细胞内抗菌能力。(a)使用CAF杀死细菌的示意图。(b)与CAF和不同浓度过氧化氢（HCAF）孵育后EcN和(c) S.A的相对活力（n=3）。(d)不同时间CAF和HCAF孵育后EcN的相对活力(e) S.A的相对活力（n=3）。(f)不同处理后细菌铺板照片和相应的SEM图像。黄色箭头表示细菌变形和隆起。比例尺：400 nm（上）和500 nm（下）。(g) F中EcN的相对活力和(h) S.A（n=3）。(i)不同处理后用SYTO9和PI染色的EcN共聚焦显微镜图像。比例尺：50 μm。(j) CAG生物膜破坏和细胞内感染清除示意图。(k)不同处理后SYTO9和PI染色的S.A（上）和EcN（下）生物膜共聚焦显微镜图像。(l) S A和MTT法处理后的EcN(m)（n=6）。(n)不同处理后MC3T3-E1细胞S.A和(o) EcN的相对活力（n=3），经Student’s t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，不显著。
图4：CAG的抗菌机制。(a)不同处理后细菌膜通透性检测（n=3）。(b)不同处理后细菌蛋白渗漏情况（n=3）。(c)不同处理后细菌SEM图像。比例尺：1μm。(d) FACS结果显示不同处理后S.A的细菌膜电位（MP）和(e) DioC2(3)染色的EcN。(f) D和E中MP水平的统计分析（n = 3）。(g)不同处理后细菌中ATP的检测（n=3）。(h)不同处理后DCFH-DA染色的EcN共聚焦显微镜图像。比例尺：50 μm。(i) CAG通过BMP干扰和代谢紊乱杀死细菌的抗菌机制示意图。经Student’s t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，不显著。
图5：CAG细胞凋亡抑制及骨代谢调节。(a) ICP-OES不同处理后细胞中铈的相对含量。(b)不同浓度Ce3+和CAF处理后MC3T3-E1细胞的相对活力（n=6）。(c)不同处理后细胞骨架的共聚焦显微镜图像。比例尺：50 μm。(d) Western blotting （WB）结果显示不同处理后细胞凋亡相关蛋白的水平。(e) CAG浸泡在CaCl2溶液中的SEM图像。矿化颗粒以黄色标示。比例尺：20μm。(f)用Fluo-3探针染色的细胞内钙离子的共聚焦显微镜图像。比例尺：10μm。(g)不同处理后碱性磷酸酶（ALP）染色照片。左上方是真实的染色照片。比例尺：100μm。(h)不同处理后茜素红S （ARS）染色照片。左上方是真实的染色照片。比例尺：200μm。(i)在h中（n=3）ARS染色的统计结果。(j)各处理后成骨相关蛋白的WB结果。经Student’s t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，不显著。
图6：CAG介导的细胞凋亡抑制和骨代谢调节机制。(a)差异表达基因的火山图。一些重要的基因被标记为红色。(b) LPS组与LPS+CAG组基因差异表达热图。(c)氧化石墨烯对差异表达基因富集的途径进行分析。(d)差异表达基因富集通路的KEGG分析。(e)与细胞因子和细胞因子受体相关的病毒蛋白，(f)钙信号通路，(g) TGF β信号通路，根据基因集富集分析（GSEA）。(h) WB结果显示CAG上调Bmp2/Smad5通路。(i) CAG抑制细胞凋亡和促进成骨分化的示意图
图7：CAG治疗金黄色葡萄球菌性骨髓炎的近期疗效观察。(a)金黄色葡萄球菌（S.A）诱导的骨髓炎模型的实验过程示意图。(b)小鼠胫骨经各种处理后的照片。白色箭头表示缺陷位置。(c)不同处理下胫骨的H&E染色和(d) Giemsa染色。比例尺：500 μm。右边是黄色方框中的放大图像。比例尺：100μm。(e)不同处理下胫骨的Masson染色和(f) TRAP染色。比例尺：50 μm。(g)不同处理下胫骨巨噬细胞的共聚焦显微镜图像。比例尺：50 μm。白色盒子的放大图像在右边。比例尺：40μm。(h) G中M1/M2型巨噬细胞的相对荧光比（n=5）。(i)不同处理后胫骨缺损部位IFN-g和TGF-b的相对浓度（n=5）。(j)不同处理后小鼠血清中炎症因子的相对浓度（n=5），经Student’s t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，不显著。
图8：CAG对金黄色葡萄球菌所致骨髓炎的延迟治疗效果。(a)延迟性S.A诱导骨髓炎模型的实验过程示意图。(b)不同处理小鼠的体重变化（n=5）。(c)不同处理后骨周围肌肉的H&E染色。比例尺：100μm。(d)不同治疗后胫骨微CT图像。橙色箭头表示骨溶解，红色箭头表示缺损部位。(e)在d中（n=5）骨相关参数的评价。(f)不同处理下胫骨的H&E（左）和Masson（右）染色。比例尺：250μm。(g)革兰氏染色，(h) TRAP染色，(i)不同处理下胫骨OPN免疫组化染色。比例尺：100μm。(j) CAG植入后感染小鼠血液生化分析。（丙氨酸转氨酶（ALT）（U/L）、天冬氨酸转氨酶（AST）（U/L）、胆红素（TBIL）（μmol/L）、尿素（mmol/L）、肌酐（CREA）（μmol/L）、尿酸（UA）（μmol/L））经Student’s t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，不显著。
结论
综上所述，构建了一种由铈离子与阿仑膦酸钠配位的超分子水凝胶，解决了骨髓炎中细菌感染和炎症性溶骨的多重困境。基于超分子材料的特殊性质，CAG在高ROS条件下实现了“凝胶-纤维-纳米颗粒”大小的转变，对以S.A为代表的革兰氏阳性菌和以EcN为代表的革兰氏阴性菌表现出ROS增强的杀伤作用，包括破坏生物膜和消灭胞内细菌。CAG通过上调钙信号通路和TGF-b信号通路，有效抑制细菌内毒素诱导的成骨细胞凋亡，增加细胞外钙的内流，促进Bmp2/Smad5通路蛋白的表达，逆转LPS诱导的成骨分化抑制。在S.A诱导的骨髓炎小鼠中，CAG植入7天后，缺陷处细菌消失，炎症反应消退，感染诱导的破骨细胞明显减少。植入28天后，缺损部位无细菌残留，炎性溶骨得到进一步抑制，骨组织得到明显修复，血清中促炎因子含量恢复正常。治疗小鼠的重要器官切片未见明显病变和异常，说明CAG的生物学安全性。体外和体内实验表明，CAG能有效克服骨髓炎的生物膜和细菌问题，改善骨代谢失衡，加速骨组织生长，为骨感染相关适应症的治疗提供了新的视角。
全文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369702124002517
参考文献:
Zhihui Han，Shunyi Lu，Jie Cao，Shumin Sun，Nailin Yang，Shuning Cheng，Xuan Huang，Jie Wu，Jingrui Li，Liang Cheng. Materials Today Volume14, Number28 November 2024. DOI:10.1016/j.mattod.2024.11.007
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