长春应化所杨秀荣院士Bioact. Mater.：核苷酸配位聚合物-ROS基免疫调节抗菌剂-破坏植入物感染的铜绿假单胞菌生物膜

第一作者：Jinghuang Chen

通讯作者：孙健，杨秀荣

通讯单位：中国科学院长春应用化学研究所

研究速览

铜绿假单胞菌在医院感染中导致高发病率和死亡率，新批准的抗生素几十年来一直在下降。使用绿色和通用的去质子化驱动策略来筛选鸟苷酸-金属离子配位聚合物纳米颗粒（GMC），而不是在特定金属离子参与时发生结合失败。我们发现GMC-2的精确pH依赖性氧化酶样活性为铜绿假单胞菌生物膜感染编排了免疫调节的双重交响乐。具体来说，GMC-2介导的活性氧（ROS）调节触发线粒体功能障碍并释放与损伤相关的分子模式，参与模式识别受体并导致内源性先天免疫激活。同时，在弱酸性生物膜环境中GMC-2触发的ROS生成破坏了生物膜，暴露了外源性病原体相关的分子模式。与传统抗生素相比，GMC-2不会引起铜绿假单胞菌的耐药性。在感染的植入小鼠模型中，铜绿假单胞菌 生物膜被GMC-2介导的先天免疫和适应性免疫触发有效消除。这些发现为促进生物分子与金属离子结合提供了一种通用方法，并强调了精确的ROS调节平台在启动针对细菌生物膜感染的内源性和外源性免疫激活中起着关键作用。

要点分析

要点一：免疫激动剂筛选及内源性免疫激活机制。线粒体功能障碍是由GMC-2产生的过量细胞内ROS引起的。GMC-2通过释放mtDNA、刺激辅激活因子信号通路、上调IFN-I和促炎因子等途径触发内源性免疫激活。    

要点二：增强对细菌的免疫反应。GMC-2对RAW264.7细胞在铜绿假单胞菌环境中具有优势。GMC-2激活Mφ，促进其对铜绿假单胞菌的吞噬，并作为免疫系统防御细菌感染的第一道防线。

要点三：医用植入物感染动物模型。GMC-2治疗医用假体铜绿假单胞菌生物膜感染的有效性。GMC-2组与空白对照组的体重曲线无显著差异。此外，细胞毒性和溶血率测试，验证了GMC-2具有生物相容性。

要点四：体内免疫分析。GMC-2激活Mφ、dc和NK细胞，触发针对细菌生物膜感染的先天和适应性免疫级联反应。

图文导读

图1：阐述了免疫调节性抗菌药物的制备及其对铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）生物膜感染的双重作用机制。(A)一种创新和通用的去质子驱动策略，用于配合鸟苷酸（GMP）与Mn⁺，避免了特定金属离子参与时GMP-Mn⁺结合的失败，并开发出具有精确的pH依赖氧化酶样活性的GMP-Mn²⁺配位聚合物纳米颗粒-2（GMP-Mn²⁺+CPNs-2，称为GMC-2）。(B) GMC-2介导的活性氧（ROS）调节触发线粒体功能障碍并释放损伤相关分子模式（DAMPs），参与模式识别受体（PPRs）并导致内源性先天免疫激活。同时，GMC-2在轻度酸性生物膜环境中引发的ROS生成破坏了生物膜，暴露了外源性病原体相关分子模式（PAMPs）。P. aeruginosa生物膜可以通过精确的ROS调节平台触发内源性和外源性免疫反应而有效消除。    

图2：活性氧调节平台的制备与表征。(A) GMP-Mn⁺ CPNs合成路线示意图。(B) GMP静电电位（ESP）图。(C)用MnCl₂在D₂O中对GMP进行¹H和³¹P核磁共振滴定。(E) GMP-Mn⁺ CPNs上氧还原反应的吉布斯自由能谱。(F) GMP-Mn⁺沉淀物的国家摘要；每个反应的pH值都显示出来。(G)加入60 μL 1 M NaOH溶液（n=3）后，典型无定形GMP-Mn⁺ CPNs的类氧化酶活性。上图为无定形GMP-Mn⁺ CPNs在水溶液中的表现。中间插图是由相应CPN催化的3，3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）溶液的光学图像。(H)无定形GMP-Mn⁺CPNs的Michaelis-Menten曲线。(1)在氧气（O₂）、空气、氮气（N₂）下GMC-2检测电流的极化曲线。(J) GMC-2精确的pH依赖性氧化酶样活性。    

图3：免疫激动剂筛选及内源性免疫激活机制。(A)与GMP-Mn⁺沉淀物孵育的RAW264.7细胞上清液中干扰素-β (IFN-β)浓度。(B)不同配方的上清液中IFN-β的浓度（n=3）。(C)抗坏血酸（AA）清除活性氧（ROS）。(D)不同AA浓度下RAW264.7细胞的IFN-I激活情况（n=3）；(E) 2′，7′-二氯荧光素（DCF）荧光强度（n=4）；(F) ROS荧光图像；(G) γ-H2AX荧光强度（n=4）；(H)不同处理下RAW264.7细胞胞浆mtDNA相对拷贝数（n=3）；(I)不同制剂RAW264.7细胞上清液中IFN-β (n = 4)和(J)不同制剂后肿瘤坏死因子-α(TNF-α) （n=5）浓度。(K)主成分分析（PCA）图，(L)京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，(M)基因集富集分析（GSEA）， (N)不同配方后RAW264.7细胞转录组差异表达基因的热图；红色,upregulation；以上；差别蓝色，对这些|log2倍变化|≥1，p<0.05。(6) GMC-2的内源性免疫激活机制。Ns无统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。    

图4：外源性病原体相关抗原释放。(A) GMC-2对浮游铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的抑菌活性（n=4）。(B)不同配方后铜绿假单胞菌代表性扫描电镜（SEM）图像。(C) GMP、Mn²⁺和GMC-2对铜绿假单胞菌的抑菌效果（n=3）。(D)细菌菌落计数图像。(E)铜绿假单胞菌DCF荧光强度的典型流式细胞术图。(F)三维共聚焦显微图和(G)铜绿假单胞菌生物膜Syto 9/PI染色的代表性流式细胞术图。(H)铜绿假单胞菌耐药性评估。(I) P. aeruginosa的最低抑菌浓度（MIC）和(J)抑菌效率（n=5）。(K) P. aeruginosa转录组的全基因，(L) Volcano图，(M)耐药基因；红色，upregulation;以上；差别绿色，对这些|log2倍变化|≥1，p<0.05。(N) GMC-2从铜绿假单胞菌生物膜中释放外源性病原体相关抗原的机制。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5：增强免疫细胞对抗细菌的免疫力。(A)与铜绿假单胞菌孵育24 h后RAW264.7的活/死染色显微镜图像和(B)冷薄切片和透射电镜（TEM）图像。(C)铜绿假单胞菌菌落（n = 6），(D) IFN-β (n=4)，(E) TNF-α (n=4)，(F) IL-1β (n=3)，(G)与铜绿假单胞菌孵育24 h后RAW264.7上清液中IL-6 （n=3）浓度。(H)小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和(I)小鼠骨髓源性树突状细胞（BMDCs）处理24 H后的代表性流式细胞术图和定量分析（n=3）。(J) RAW264.7与绿色荧光蛋白标记的P. aeruginosa（GFP-P）孵育后的旋转盘共聚焦激光扫描显微镜图像。a)处理1h后，用Hoechst和WGA染色。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6：药物植入物感染小鼠模型的治疗。(A)该方案显示了植入铜绿假单胞菌生物膜感染小鼠模型的构建和给药情况。(B)单个感染区生长曲线（n=6）。(C)给药后手术区代表性照片。(D)苏木精和伊红（H&E），(E)细胞角化蛋白10/细胞角化蛋白14 （CK10/CK14）免疫荧光染色，(F) Giemsa，(G) Masson，(H) CD31免疫荧光染色，(I) Ki67免疫荧光染色第5天不同处理后感染周围组织的典型图像。(J)-(M)个体组织学染色定量分析，菌落n=10；胶原蛋白、CD31和Ki67的n=6。(N)显示肝肾功能和全血细胞计数的热图，以评估生物相容性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7：体内免疫分析。(A)免疫分析过程示意图。(B)通过门控CD11b⁺F4/80⁺细胞的M1表型巨噬细胞（M1 Mφ，CD80⁺CD206^-），(C)通过门控CD11c⁺细胞的成熟DCs (CD80⁺ CD86⁺), (D) T辅助细胞（CD³⁺CD⁴⁺CD^-1），细胞毒性T细胞（CD³⁺CD⁴⁺CD⁸⁺）和(E)通过门控IDLN中的CD49b⁺细胞的活化自然杀伤细胞（CD107a⁺）的典型流式细胞术图和定量分析（n=3）。(F)-(I)脾脏相应的图和分析。(J)小鼠血清中IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度（n=4）。(K) GMC-2级联催化先天和适应性免疫对抗细菌生物膜感染的示意图。以ns表示无统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。

结论

综上所述，我们提出了一种绿色且通用的逐步去质子驱动策略来协调GMP与过渡金属，而不是在特定金属离子参与HEPES缓冲液和去离子水反应体系中发生GMP-Mn⁺结合失败。令人印象深刻的是，与其他GMP-Mn⁺ CPNs和报道的酶模拟复合物相比，我们筛选出具有优异氧化酶样活性的无晶态GMP-Mn²⁺ CPNs （K_m=63.565 μM，V_max=1.463 μM s^-1）。通过GMC-2对ROS进行微妙调节，使线粒体功能障碍，氧化应激诱导的mtDNA（DAMPs）释放到细胞质中，从而参与PRRs，导致宿主内源性先天免疫激活。GMC-2在轻度酸性生物膜环境中产生足够的ROS，容易破坏细菌生物膜，暴露外源性细菌相关抗原（PAMPs）。与氨苄青霉素相比，GMC-2不能引起铜绿假单胞菌的耐药。GMC-2（0.25×MIC）

减轻铜绿假单胞菌介导的巨噬细胞损伤，与低浓度氨苄西林相反，后者没有。此外，在小鼠种植体感染模型中，GMC-2通过触发先天免疫和适应性免疫，有效地消除了铜绿假单胞菌生物膜，加速了感染组织的修复。该研究提供了一种绿色且通用的逐步去质子驱动策略，促进生物分子与营养金属离子的结合。此外，本研究结果为抗菌免疫治疗提供了一个具有明确机制的范例，并强调了ROS的精确调节在启动对铜绿假单胞菌生物膜感染的内源性和外源性免疫应答中至关重要。

全文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24004791

参考文献:

Jinghuang Chen，Xianqing，TangQihan Sun，Xin Ji，Xingbo Wang，Zhendong Liu，Xu Zhang，Haijiao Xu，Fan Yang，Jian Sun，Xiurong Yang. Bioactive Materials 44 (2025) 461–473. DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.10.026

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