第一作者：Peng Wang
通讯作者：毛铎，刘斌，王康男
通讯单位：中山大学第一附属医院，新加坡国立大学化学与生物分子工程系，山东大学晶体材料国家重点实验室
研究速览
近期，中山大学毛铎团队，新加坡国立大学刘斌团队，山东大学王康男团队联合在Advanced Materials上发表了靶向细胞核的光敏剂，以增强中性粒细胞细胞外陷阱，有效根除多重耐药细菌感染的文章。中性粒细胞细胞外陷阱 （NET） 是由活化的中性粒细胞挤出的 DNA 和蛋白质的网状复合物，在对抗病原体入侵的先天免疫反应中起着重要作用。然而，一些微生物已经开始逃避NET攻击，导致免疫防御受损和持续感染。在这项研究中，开发了一种用于增强 NETs 抗菌活性的工程化中性粒细胞策略。合成了具有强活性氧产生和强 DNA 结合能力的细胞核靶向光敏剂 （NCP）。随后通过 NCP 与中性粒细胞直接孵育来构建装载 NCP 的中性粒细胞，并将 NCP 紧密插入细胞核 DNA 中。在被细菌相关毒素激活后，NCP 偶联的 NET 可以迅速释放，主动捕获细菌并在它们周围提供高浓度的局部 NCP。体外和体内结果表明，NCP 偶联的 NETs 可以通过光动力疗法有效根除各种多重耐药细菌和生物膜，克服细菌免疫逃逸，并促进组织从严重伤口感染中恢复。这种设计可以显着增强 NET 功能，为治疗细菌传染病提供非抗生素替代平台。
要点分析
要点一：一些细菌已经进化出内在机制来逃避NETs。例如，铜绿假单胞菌分泌DNA酶和磷酸酶，它们共同作用，降解NETs的结构，减轻DNA毒性，促进生存和传播金黄色葡萄球菌，也产生几种干扰NETs抗菌能力的蛋白，促进细菌从NET结构中逃逸，导致细菌清除延迟和感染导致的死亡率增加。此外，细菌生物膜促进NETs的形成，并具有通过自身分泌的毒素阻止细菌清除的机制，从而导致细菌在体内增殖和慢性感染。因此，开发防止细菌逃离的新策略至关重要。
要点二：在光照下，光敏剂可被激发产生ROS， ROS通过氧化细菌DNA和细胞质膜对邻近细菌造成致命伤害。PDT的一个优点是它独立于细菌耐药途径，即使在多次治疗后也能防止耐药性。然而，将PDT中使用的光敏剂与传统抗生素区分开来的一个关键限制是它们对体内感染性细菌的选择性相对较低，这可能导致体内非特异性生物分布，并在治疗期间对正常组织造成损害。因此迫切需要提高光敏剂对感染性细菌的选择性。考虑到NETs在识别和捕获细菌中发挥的关键作用，认为将光敏剂与NETs偶联是实现体内细菌靶向递送光敏剂，同时通过PDT增强NETs的杀菌功效的有希望的途径。为了开发这种基于net的抗菌策略，需要一种具有有效ROS生成和强发射的光敏剂，它可以促进精确和高效的成像引导抗菌PDT。此外，光敏剂应具有强大的DNA结合能力，有效的中性粒细胞细胞核标记。
要点三：在该设计中，合成了具有强ROS生成，明亮荧光和特定DNA偶联能力的NCP。喹啉盐通过共轭双键与咔唑偶联，得到了D -𝜋-A结构的光敏剂。引入（N -乙基）咔唑和共轭双键分离了最高已占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）的分布，增加了系统间的交叉程度，有利于ROS的生成。NCPs可以有效地插入到双链DNA 的主要凹槽中，确保了高的核标记效率。在中性粒细胞被NCP标记后，将装载NCP的中性粒细胞（NLNs）静脉注射到多药耐药细菌感染的小鼠伤口中。NLNs迅速迁移到感染部位，以响应急性炎症信号。PDT有效地根除了捕获的细菌和生物膜，导致严重感染的伤口组织完全恢复。这种光敏剂工程抗菌策略加强了与NETs相关的宿主防御机制，以有效去除多重耐药细菌。
图文导读
图1. a)基于NET的抗菌治疗示意图。A)光敏剂NCP的化学结构。B) NLN介导的PDT治疗细菌性伤口感染示意图。C)小鼠静脉注射后NLN靶向感染部位示意图：1)炎症信号沿趋化梯度募集NLN；2) MLM从血管外移外渗，穿透细菌感染组织；3) NLNs被细菌相关毒素过度激活释放N-NETs，导致细菌捕获并与NCP结合。D) PDT法N-NET释放及细菌捕获和根除过程。
图2.所研制光敏剂的表征。A-C) NC、NCP和NCPP分别与dsDNA的分子对接模型。D)在pH为7.4的10 mM Tris-HCl缓冲液（含5% DMSO）中，用5 μM NCP溶液滴定ds26DNA 的ITC热像图。E)热变随NCP-DNA摩尔比的等温线图。F)用NCP/NCPP对dsDNA - DAPI配合物进行荧光滴定。dsDNA - DAPI复合物在405 nm处激发。G)相同摩尔浓度（1 μM）下NC、NCP和NCPP的紫外可见吸收光谱和H)荧光发射光谱。I)•在不同浓度的dsDNA存在下，NC、NCP、NCPP和Ce6生成-OH的能力，用HPF测量。J)用DCFH测量的NC、NCP、NCPP和Ce6在白光照射下总ROS生成能力。
图3.体外中性粒细胞标记和N-NET的形成。A)共聚焦图像和B)纯化中性粒细胞与NCPs孵育30分钟后的相应线扫描图（红色）。C)共聚焦图像和D)中性粒细胞与NCPs孵育30分钟后的相应线扫描图（红色），然后用PMA处理4小时。细胞核和NETs用Hoechst 33342染色（蓝色）。E)流式细胞术分析NCPs的中性粒细胞标记效率。F) SYTOX蓝存在后，用PMA处理NLNs或中性粒细胞的NETs荧光定量分析。G) DCFH-DA（总ROS指标）染色后白光照射nln的流式细胞术分析。H) fMLP孵育后NLN或中性粒细胞中CD11b表达水平的变化。
图4. NCPs偶联NETs捕获和杀死细菌。与A) GFP+金黄色葡萄球菌和B) GFP+大肠杆菌共培养NLNs的共聚焦图像。细胞核和NETs用Hoechst 33342染色（蓝色）。C)光照射后，与NLNs或中性粒细胞共培养的MRSA细菌活力。D)在DNase I存在下，MRSA与NLNs共培养的细菌活力，随后进行光照。 E)三维共聚焦图像，F)不同时间间隔与NLNs孵育的MRSA生物膜的相应剖面图。G)三维共聚焦图像和H)不同时间间隔与NLN孵育的铜绿假单胞菌生物膜的相应剖面图。NLN处理的I) MRSA和J) P. aeruginosa生物膜在不同深度和不同孵育时间下的平均荧光强度（FLI）（%）。在光照下，不同数量NLNs孵育K) MRSA和L) P. aeruginosa生物膜的细菌活力。
图5.细菌感染小鼠NLNs的体内荧光成像。A)金黄色葡萄球菌感染小鼠静脉注射NLNs后的体内荧光成像。不同时间间隔接受B) NLN或C) DiR标记的中性粒细胞的小鼠感染区域的平均荧光强度。D) NLN和DiR标记的中性粒细胞的信噪比。E) NLNs给药后7小时小鼠不同器官的离体荧光成像。F)给药NLNs 7小时后不同器官平均FLI的定量分析。G)连续静脉注射右糖聚糖-FITC（绿色）和NLNs（红色）后，细菌感染组织中NLN行为的延时双光子图像序列，包括快速向炎症迁移和跨血管运动。H)静脉注射NLN和右旋糖酐- fitc后5分钟和30分钟细菌感染组织中NLN积累的双光子图像。I)静脉注射NLNs后30分钟和4小时细菌感染组织中NLNs N-NET释放的双光子3D图像。
结论
总之，本文开发了一种新的基于细胞的抗菌策略，即在中性粒细胞细胞核中加入光敏剂。研究结果证实了NNETs在选择性靶向和捕获多药耐药细菌及其相关生物膜方面的优异性能。此外，这些定制的NETs利用成像引导的PDT有效地根除了固定的细菌，从而促进了细菌感染的伤口组织的恢复。在这项研究中，利用NETs固有的抗菌机制来实现精确的细菌根除，开发了一个独特的平台来增强宿主对一系列细菌性伤口感染的免疫防御，这可以克服基于抗生素治疗的几个局限性。由于这些独特的优势，该方法在治疗严重的细菌感染性疾病方面具有相当大的临床应用潜力。
全文链接： https://doi.org/10.1002/adma.202400304
参考文献：Peng Wang, Qingqing Bai, Xianglong Liu, Minyang Zhao, Lei Chen, Fang Hu, Jinzhou Ye,Xinhan Chen, Kang-Nan Wang,* Bin Liu,* and Duo Mao*. Nucleus-Targeting Photosensitizers Enhance Neutrophil Extracellular Traps for Efficient Eradication of Multidrug-Resistant Bacterial Infections. Adv. Mater. 2024, 2400304
DOI: 10.1002/adma.202400304
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