第一作者：Rong Huang, Yongqian Bian , Wenxuan Wang
通讯作者：李学拥、李靖
通讯单位：空军军医大学第二附属医院
研究速览
近期，空军军医大学第二附属医院的李学拥和李靖教授团队在Carbohydrate Polymers上发表了题目为Antibacterial chitosan/organic rectorite nanocomposite conjugated gelatin/β-cyclodextrin hydrogels with improved hemostasis performance for wound repair的文章。细菌感染和严重出血仍然是伤口修复的重大挑战。目前迫切需要具有抗菌和止血特性的创新型自然启发水凝胶敷料。通过使用 EDC/NHS 交联技术将 β-CD 和 CS-OREC 纳米复合材料接枝到 Ge 基质中，开发出了 Ge-β-CD-CS-OREC 共轭水凝胶，并通过傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和乙二胺四乙酸氧化物（EDX）分析证实了这一点。与单一的 Ge-β-CD 交联水凝胶相比，CS-OREC 的加入增强了水凝胶的性能，包括增加了孔径（60 ± 14 μm）、改善了润湿性（WCA= 28.82 ± 0.6°）、提高了拉伸强度（41.3 ± 3.56 KPa）和较强的组织粘附性。此外，这种水凝胶在与角质细胞（Kcs）和血管内皮细胞（VECs）共培养时表现出了极佳的细胞相容性。在 OREC 夹层中加入 CS 链后，水凝胶就能特异性地靶向细菌，并增加铜绿假单胞菌（PA）、肺炎克雷伯氏菌（KP）和金黄色葡萄球菌（SA）的膜渗透性，与体内对照组相比，能有效地将感染伤口中的细菌量减少 50.24-73.92%。此外，通过增强 血小板活化和凝血因子分泌，水凝胶表现出优于市售纱布和其他凝胶的止血效率 （78 ± 10 s）。水凝胶通过促进上皮成熟和血管再生来加速组织再生，表明其作为有前途的伤口敷料的临床潜力。
要点分析
要点：本研究合理地设计了一种与 EDC/NHS 交联的 Ge-β-CD-CS-OREC 水凝胶，以实现伤口愈合的理想特性，包括组织粘附性、柔韧性、抗菌性和止血能力。为了进行比较，还制作了 Ge-β-CD 和 Ge-β-CD-CS 凝胶。利用各种技术系统地表征了 CS 和 OREC 对透射率、形态、化学结构、表面亲水性、溶胀率、保水性、期刊预览版期刊预览版机械强度和粘附性等各种特性的影响。此外，还深入研究了复合水凝胶的生物相容性、抗菌活性、止血能力、长期降解行为、伤口愈合潜力以及调节其功能的内在机制，从而证明了 Ge-β-CD-CS-OREC 水凝胶敷料的临床应用潜力。
图文导读
图1. GCCO 水凝胶的制备和表征。(A) 利用 Figdraw，通过 EDC/NHS 催化 GC 中的羧基与带正电荷的 CS-OREC 的氨基之间的酰胺化反应，制备出夹杂 CS-OREC 化合物的 GC 复合水凝胶的过程示意图。(B)多功能 GCCO 复合水凝胶的结构设计以及凝血、抗感染和伤口修复的工作机制。(C) GC、GCC 和 GCCO 水凝胶交联前后的照片，凝胶时间用小瓶倾斜法测定。(D) 各种水凝胶的透明度。(E) 具有代表性的水凝胶表面截面（a、c、e）和横截面（b、d、f）的扫描电镜显微照片。(g）所有水凝胶的孔径，数据以平均值 ± SD 表示（n = 3）。(F）水凝胶的水接触角（WCA）。(G）傅立叶变换红外光谱数据。(H）WAXRD 图谱。
图2. (A) Kcs 在 TCPs（Con）、GC、GCC 和 GCCO 水凝胶上迁移到 500 μm 的伤口缝隙中，分别在孵育 0、6、12、18 和 24 小时后显示。细胞用 活细胞示踪剂CMFDA(绿色)标记，并用 ICLSM 观察。比例尺：200 μm。(B) 不同组 Kcs 迁移率的量化，定义为剩余伤口面积占原始伤口面积的比例。数据以平均值 ± SD 表示（n = 6），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(C) 用 PBS（对照组，Con）和 GC、GCC 和 GCCO 凝胶提取物处理 1、2、3 和 5 天的 Kcs 存活率定量分析。数据以平均值 ± SD 表示（n = 6）。(D) 与水凝胶共同培养 1、2、3 和 5 天的各组 Kcs 形态光学显微镜图像。缩放条：100 μm。(E) 通过宏观和显微镜观察、FI-TC-类胶原蛋白、VE-粘连蛋白和 DAPI 成像以及 Sirus 红染色水凝胶横截面，从制备的水凝胶表面对可分离的 Kcs 细胞膜进行形态学评估。缩放条：100 微米。(F) CMFDA 标记的 HUVEC 在指定时间点迁移到 TCPs（Con）、GC、GCC 和 GCCO 水凝胶伤口间隙的荧光图像。标尺：200 μm。(G）定量分析各组 HUVEC流动性。(H）代表水凝胶上生长的 VECs形态的光学显微镜图像。
图3. GCCO 水凝胶的抗菌活性和机理。(A-B) GC、GCC、GCCO 和阳性对照（青霉素-链霉素溶液 A，PSSA）对铜绿假单胞菌（PA）、肺炎克雷伯菌（KP）和金黄色葡萄球菌（SA）的数字图像（A）和 ZOI 图（B）。(C) PA、KP 和 SA 细菌菌落的照片以及所有水凝胶浸泡后的杀菌效率。将细菌悬浮液涂抹在水凝胶表面并在 37°C 下培养 24 小时，然后收集细菌悬浮液进行稀释和平板计数。(D-E) PA、KP 和 SA 与/不与各种水凝胶共培养 12 小时后的 SEM（D）和 TEM（E）图像。
图 4. 水凝胶的体内抗菌活性。(A) 用 PA、KP 或 SA 对伤口部位进行预污染并用/不用 GC、GCC、GCCO 处理后的照片，以及植入水凝胶 1 天后去除凝胶 (GR) 前/后重新打开切口的照片。用 PA、KP 或 SA（108 CFU/mL，10 μL）预污染水凝胶，然后将其嵌入伤口部位。虚线圆圈表示凝胶植入区域，红色箭头指向明显的感染迹象。(B）通过 16S rDNA qPCR 对第 1 天用生理盐水、GC、GCC 和 GCCO 水凝胶处理的感染伤口部位的细菌负荷（CFU/mL）进行定量评估（n = 3）。(C-D）使用 FISH 探针（16S rRNA）对伤口组织切片进行组织学分析（C），对连续切片进行 HE、LPS 和 LPA 染色（D）。红色荧光染色或深褐色染色区域为定植细菌的富集点。
图5. 使用 SD 大鼠股动脉模型评估水凝胶的止血潜力。（A） 用 GC、GCC 和 GCCO 水凝胶贴剂治疗出血的股动脉的大体观察。（B） 用不同水凝胶贴剂治疗后失血和止血时间的量化。（n = 4，*p < 0.05，**p < 0.01）。（C） SEM 显微照片显示不同时间点与血液接触的水凝胶上的红细胞 （E） 粘附和纤维蛋白网络 （F） 形成。右侧图像是左侧图像中所选区域的放大视图。（D） 处理后 2 分钟捕获的 GC、GCC 和 GCCO 水凝胶（有和没有凝血）的完整调查和去卷积 XPS 光谱。
图6. (A) SEM 观察到的 GC、GCC和 GCCO 水凝胶上血小板粘附的表面形态（红色箭头突出显示）。(B) 水凝胶的 ICLSM 图像，血凝块染色为与血液凝固相关的 CD41、GPⅥ 和 FGL2（绿色）。凝胶支架（GS）用罗丹明（红色）标记。(C) 通过 Western 印迹分析 CD41、GPⅥ 和 FGL2 的相对表达水平。(D) 通过 RT-PCR 定量 CD41、GPⅥ 和 FGL2 的 mRNA 表达水平。
图7. 水凝胶的体内降解行为。(A) GC、GCC 和 GCCO 水凝胶植入动物模型示意图。红色箭头表示植入的水凝胶。(B) 水凝胶在植入后不同时间点的质量降解率（MDR）定量分析。(C) 不同时期水凝胶体内降解的总体观察结果。(D) 第 7、14、28 和 56 天植入部位周围组织的 Masson 三色染色和 HE 染色切片的代表性图像。(E）第 3 天皮下植入水凝胶的水晶紫染色。白色箭头表示凝胶中的内源性细胞生长。
图 8. 水凝胶在全厚伤口模型中的伤口愈合性能。(A) 在第 0、3、5、7、10、14、18 和 21 天分别拍摄油纱布组（阴性对照组，Con）、商用金宏胶原蛋白水凝胶敷料组（JH gel）、GC、GCC 和 GCCO 处理组的伤口照片。(B-C）伪彩色图像（B）和根据照片计算出的各组伤口收缩百分比的定量分析（C）。(D) 21 天后通过 Masson 三色染色和免疫组化染色对各组伤口组织切片中的 CK10、CK15、CD31 和 vWF 进行组织形态学评估。(E) 不同处理后第 14 天，作为伤口上皮化指标的 CK10 和 CK15 的 表达水平的定量结果。(F-G）通过 CD31-vWF 共染量化血管数量（F）和平均血管直径（G）。
结论
综上所述，本研究为开发具有可行的仿生物止血和组织再生功能的多功能天然多糖基水凝胶提供了一种绿色战略。与单一的 Ge-β-CD 交联水凝胶相比，CS 和 CS-OREC 的加入使得孔径增大，润湿性和湿度相关性能得到改善，同时由于氢键和静电力的作用，水凝胶具有更强的机械强度和组织粘附强度。GCCO 水凝胶具有可塑性和柔韧性，水接触角（WCA）为 28.82 ± 0.63°，吸水率（WU）为 51.8 ± 5.34%，拉伸强度相对较高，为 41.3 ± 3.56 kPa。与原始的 Ge-β-CD 水凝胶和 CS 接枝水凝胶相比，GCCO 的生物相容性更好。这种水凝胶对 PA、KP 和 SA 具有持续抑制作用，体外抑菌率达 100%，充分发挥了 CS 和 OREC 在捕捉细菌和破坏细菌膜方面的协同作用。体内细菌感染伤口模型进一步证明，与对照组相比，期刊预防水凝胶可减少 50.24 - 73.92% 的细菌负荷。此外，复合凝胶还将止血时间大幅缩短至 78 ± 10 秒，是医用纱布所需时间的 13.68%。这种快速止血归因于电荷诱导的红细胞粘附和血小板活化，以及 CD41、GPⅥ 和 FGL2 的上调，证实了本研究的预设概念，即在 GC 聚合物网络中引入插层 CS-OREC 可通过共价交联、氢键和静电作用实现多功能整合、 从而克服了 CS-OREC 在体内机械性能脆、组织粘附力弱和生物相容性差等不足，同时保持了其独特的抗菌和止血性能。此外，GCCO 水凝胶还能显著加速体内全厚伤口的组织再生，使上皮变薄，胶原合成更有组织，新生血管增多。这些研究结果表明，该产品具有强大的潜力，可作为理想的载药急救伤口敷料，促进受多重耐药细菌感染的开放性或不可压缩的不规则伤口的快速止血、抑菌和组织再生。从更广泛的意义上讲，GCCO 水凝胶的三维打印性也为其未来作为有效的局部给药载体和组织工程支架开辟了广阔的应用前景。
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122961
参考文献：R. Huang, Y. Bian, W. Wang, et al., Antibacterial chitosan/ organic rectorite nanocomposite-conjugated gelatin/β-cyclodextrin hydrogels with improved hemostasis performance for wound repair, Carbohydrate Polymers (2024), https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122961 e703. https://doi.org/10.1002/agt2.703
DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122961
投稿联系：kangjunkejiquan@163.com
欢迎各位抗菌同仁进群交流（抗菌科技圈）！
由于群人数已满200，各位业界同仁可以添加小编微信（wei315317或xb_15273285712）邀请进群。
