第一作者：Li Zhou, Qing Liu, Zehui Fang
通讯作者：王海明 李全利
通讯单位：香港大学牙医学院/深圳市龙岗耳鼻喉医院口腔科口腔科学研究所
研究速览：
具有广谱活性的单一功能药物往往会扰乱口腔的生态平衡，无法满足牙科治疗需求。需要具有专门靶向杀伤特性和原位再矿化作用的多功能试剂用于龋齿管理。该研究制备并评估了一种新型多功能剂 （8DSS-C8-P-113），由非特异性抗菌肽 （AMP） （P-113）、能力刺激肽 （C8） 和增强再矿化结构域 （8DSS） 三个结构域组成。研究结果表明，2 μM mL-1 的 8DSS-C8-P-113 可消除浮游变异链球菌 （S. mutans），而不会破坏口腔正常菌群。在 8 μM mL-1 的浓度下，它表现出防止突变链球菌粘附的能力。此外，8DSS-C8-P-113 在 16 μM mL-1 的较高浓度下自组装水凝胶状态。这种水凝胶自粘附在牙齿表面，抵抗酸的侵蚀，根除变形链球菌的生物膜，并诱导矿化，以促进脱矿质的牙齿硬组织的修复。它在降低龋齿严重程度方面的显着有效性也在大鼠模型中的体内得到证明。该研究表明，多功能生物活性 AMP 8DSS-C8-P-113 是一种很有前途的药物，可以特异性靶向病原体，防止牙齿脱矿，并有效诱导原位模拟生物再矿化，用于治疗龋齿。
要点分析：
要点一：抗生素替代品 AMPs 存在广泛且表现出广谱活性，科学家已经研究出了杀死特定病原体而不影响正常微生物菌群的 AMPs。
抗生素是现代医学的基石，在预防和治疗微生物感染性疾病方面发挥着重要作用。然而，抗生素的过度使用和由此产生的细菌耐药性降低了药物的有效性，对公共卫生构成威胁。抗菌肽 （AMPs） 和蛋白质是先天免疫的关键成分，由于其强大的抗菌活性和低细菌耐药性，已被公认为潜在的抗生素替代品。AMPs 存在于不同的物种中，包括人类、哺乳动物、两栖动物、昆虫、微生物和植物，具有不同的结构，如α螺旋、β片和线性延伸。在口腔中，AMPs 在唾液腺、口腔粘膜、骨髓和牙髓中表达，以实现免疫激活、炎症和伤口愈合。AMPs 还与 α-防御素、β-防御素、组蛋白、唾液蛋白、导管素和肾上腺髓质素一起工作，以维持宿主和微生物之间的动态平衡。 AMPs 通常对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母菌、真菌和病毒表现出广谱活性。然而，广谱活性会改变天然微生物群的生态和谐，导致生态失调。最近，已经研究了杀死特定病原体而不影响正常微生物菌群的 AMPs。这些特异性（或选择性）靶向抗菌肽 （STAMPs） 由两个功能独立的肽组分组成：一个由高亲和力结合肽组成的靶向区域，用于识别细菌，另一个由非特异性 AMPs 组成的杀伤区域，用于破坏细菌。
要点二：变形链球菌是导致龋齿的主要细菌，特异性靶向抗菌肽（STAMPs）能够精确地攻击变形链球菌而不损害其他口腔内的非致病细菌，有助于保持口腔微生态的稳定。
变形链球菌 （S. mutans） 是一种兼性厌氧革兰氏阳性球菌，已被确定为人类龋齿的主要致病因素。变形链球菌有效地定植到牙齿表面，利用膳食蔗糖作为能量来源，并发酵葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖等碳水化合物以产生乳酸。这些酸性副产物的 pH 值低于 5.5，会侵蚀牙齿的羟基磷灰石 （HAP） 晶体结构，导致龋齿。蛀牙进展到牙髓会导致炎症和疼痛，并会显着影响基本功能，如进食、咀嚼、微笑和交流。因此，抑制变形链球菌对于预防龋齿的发生至关重要。有很多 AMPs 杀死了变形链球菌，包括人天然 AMPs，如 LL37、hBD-2、hBD-3、HNP1、HNP2、HNP3 和 Histatin 5;以及合成、模拟或修饰的天然 AMPs，如 KR12-KAKE、hBD3-C15、dhvar 5 和 P-113。这些 AMPs 都具有广谱活性。例如，LL37 可以杀死 S. sobrinus、S. salivarius、S. sanguis 和 S. mitis ，同时杀死变形链球菌。然而，由具有 8 个氨基酸 TFFRLFNR （C8） 的能力刺激肽 （CSP） 组成的 STAMP用于靶向变异链球菌的 ComD 受体和用于破坏变异链球菌的非特异性 AMP G2 可以杀死变异链球菌，而不会影响其他非致病性物种，例如 S. gordonii Challis 和 S. sanguinis。这种特定于物种的靶向策略有效地保护了口腔正常菌群。
要点三：P-113具有广谱抗菌作用，可能对正常的口腔菌群造成潜在危害。
P-113 （AKRHHGYKRKFH） 是人 AMP 组蛋白 5 的衍生物。P-113 由 12 个氨基酸组成，保留了母体分子的抗菌和抗真菌活性。它对铜绿假单胞菌（囊性纤维化的主要病原菌）、葡萄球菌（大多数感染的主要病原菌）、白色念珠菌（念珠菌病的主要病原菌）和变形链球菌（龋齿的主要病原菌）具有广谱抗菌作用。在之前的研究中，我们设计并制造了一种双功能 AMP P-113-DPS。它的 P-113 对变异链球菌具有抗菌活性，两个带负电荷的磷酸盐酸酯 （DPS） 强烈吸引 Ca2+，使其在酸性病变的牙釉质表面具有更好的再矿化能力。尽管 P-113 或 P-113-DPS 能够抑制变形链球菌，但它们的广谱活性可能对正常的口腔菌群造成潜在危害。
要点四：基于 STAMP 策略，研究团队计划实验确定具有最佳生物活性的最佳多功能 AMP。
基于 STAMP 策略，研究团队计划设计一种具有三个成分的新型功能性 AMP：非特异性 AMP （P-113）、特异性靶向结构域 （C8） 和增强再矿化结构域。DPS 和 24 个氨基酸 DSSDSSDSDSDSDSDSDSDSDSDSSDSS （8DSS） 被选为增强再矿化的候选药物。因此，该研究制备了 C8-P-113-DPS、DPS-C8-P-113、C8-P-113-8DSS 和 8DSS-C8-P-113 四种多功能 AMPs。研究人员首先旨在确定在 C8-P-113-DPS、DPS-C8-P113、C8-P-113-8DSS 和 8DSS-C8-P-113 中具有最佳生物活性的最佳多功能 AMP。评估了以下生物活性特性：（1） 抗菌活性;（2） 肽的表征;（3） 促进再矿化的能力;（4） 在人工龋齿模型中抑制脱矿的能力。其次，进行了机制研究，并通过转录组学分析研究了最佳多功能 AMP 的抗菌活性。其次，通过分子动力学 （MD） 分析探索多功能 AMP 改善再矿化的最佳活性。最后，建立大鼠龋齿模型，评价最佳多功能 AMP 抗龋齿疗效及其生物相容性。
图文导读
图 1.抗-S.变聚糖粘附和抗-S。多肽溶液的变聚糖生物膜活性。（a） 不同组、不同浓度的变形链球菌粘附在肽包被牙釉质表面的荧光图像 （ × 60）。（b） 孵育 5 小时后，变形链球菌粘附在肽包被的牙釉质表面的活菌计数。（c） 不同浓度肽溶液中变形链球菌生物膜的荧光图像 （ × 60）。（d） 暴露于不同浓度的肽溶液 24 小时后，变形链球菌生物膜的活菌计数（左：纵坐标和点图）和活菌计数减少百分比（右：纵坐标和条形图）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与对照组相比。8DSS-C8-P-113 水凝胶肽染成绿色，用箭头表示。
图 2.肽的表征、TEM 显微照片、稳定性和细胞相容性。（a） HEPES 中 1 μM mL-1 C8-P-113、DPS-C8-P-113 和 8DSS-C8-P-113 （pH = 7）。（b） 溶解 10 分钟后，16 μM mL-1 C8-P-113、DPS-C8-P-113 和 8DSS-C8-P-113 溶于 HEPES （pH = 7） 中。（c） 浓度为 16、8、4 和 2 μM mL-1 的 8DSS-C8-P-113，在后三种浓度下观察到明显的两层状态。（d-f）C8-P-113、DPS-C8-P-113 和 8DSS-C8-P113 的 TEM 显微照片（× 10,000 张）。（克-小时）8DSS-C8-P-113 水凝胶 （ × 50,000） 和 8DSS-C8-P-113 水凝胶 （ × 10,000） 的 FE-SEM 显微照片。（i） 在 37◦C 下在人唾液中孵育的肽在 6 小时内的剩余百分比的变化。（j） 在 2 小时内以 30 mL h-1 的速率在流水中孵育的 8DSS-C8-P-113 水凝胶剩余百分比的变化。（k） 细胞在肽溶液中暴露 24 小时后的细胞存活率。*与对照相比，p < 0.05。（l） MC3T3-E1 在肽包被的牙釉质表面增殖 1 天和 3 天。（m） MC3T3-E1 在肽包被的牙釉质表面 1 天和 3 天的荧光图像 （ × 10）。
图 3.再矿化试验。箭头表示针状晶体的厚度。（a-f）第 1 天 C8-P-113 （MBC）、DPS-C8-P-113 （MBC）、8DSS-C8-P-113 （MBC）、8DSS-C8-P-113 （16 μM mL-1）、琼脂糖和对照组再矿化截面的 FE-SEM 显微照片 （ × 10,000）。（g-l）第 3 天不同组的 FE-SEM 显微照片 （ × 2000）。（m-r）第 7 天不同组的 FE-SEM 显微照片 （ × 1000）。（s） 显微照片的放大倍数 （p） （ × 20,000）。大支架表示 8DSS-C8-P-113 水凝胶层的厚度。（t） 显微照片的放大倍数 （u） （ × 10,000）。（u） 显微照片的放大倍数 （r） （ × 2000）。（v） 在再矿化溶液中孵育 1 天、3 天和 7 天后，不同表面处理的牙釉质标本的维氏硬度。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与同一天的对照组相比。（w） 在再矿化牙齿表面形成的压痕。
图 4.人工模型中牙釉质表面病变的横截面。（a-f）C8-P113 （MBC）、DPS-C8-P-113 （MBC）、8DSS-C8-P-113 （MBC）、8DSS-C8-P-113 （16 μM mL-1）、琼脂糖和对照组脱矿质截面的 MicroCT 图 （ × 50）。（g） 牙釉质表面的病变深度。（h） 牙釉质表面病变的矿物质密度。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与对照组相比。
图 5.通过 LDH 测定、水不溶性 EPS 和变形链球菌转录组学分析评价 8DSS-C8-P-113 的抗菌活性机制。（a） 不同浓度 8DSS-C8-P113 中 LDH 活性相对于对照组的 LDH 活性。（b） 不同浓度 8DSS-C8-P113 中变形链球菌生物膜水不溶性 EPS 的定量。（c） 变形链球菌（细菌，染成绿色;EPS，染红）。（d） 不同浓度 8DSS-C8-P113 中细菌和 EPS 生物量的定量数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与对照组相比。（e） 对照组和 8DSS-C8-P-113 处理组之间变形链球菌中 DEGs 的火山（|log2fold change| > 1 和 P < 0.05）。横坐标表示基因表达的倍数变化，而纵坐标表示显著的统计差异。红点代表显著上调的基因，蓝点代表显著下调的基因，灰点代表差异表达不显著的基因。（f） 对照组和 8DSS-C8-P-113 处理组之间 DEGs 的热图。红色代表较高的表达水平，而蓝色代表较低的表达水平。（g） 对照组和 8DSS-C8-P-113 处理组之间上调和下调基因的 GO 富集分析。x 轴显示显著的统计差异，y 轴表示在上调和下调基因中富集的 GO 术语。红色和蓝色分别表示上调和下调的基因。（h） 对照组和 8DSS-C8-P-113 处理组之间上调和下调基因的 KEGG 通路富集分析。x 轴显示显著的统计差异，y 轴表示富含上调和下调基因的 KEGG 通路。红色和蓝色分别表示上调和下调的基因。
结论
多功能试剂 8DSS-C8-P-113 设计用于靶向消除变形链球菌，同时保留戈氏链球菌和血链球菌等有益细菌。在 2 μM mL-1 的浓度下，它可有效杀死变形链球菌，激活破坏细胞膜的跨膜受体，抑制肽聚糖生物合成，并降低 DNA 聚合酶活性。在 8 μM mL-1 时，它通过干扰糖酵解来防止变形链球菌粘附，而在 16 μM mL-1 时，它通过破坏群体感应和抑制细胞外聚合物物质的产生来根除变形链球菌生物膜。此外，它通过抑制 LDH 的产生并在牙齿表面形成保护性水凝胶来抑制脱矿，通过钙和磷酸根离子结合促进再矿化。在大鼠龋齿模型中，8DSS-C8-P-113 显示出实际的有效性和安全性，表明其作为预防和治疗龋齿的治疗剂的潜力。
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.10.022
参考文献：Targeted antimicrobial self-assembly peptide hydrogel with in situ bio-mimic remineralization for caries management. Li Zhou, Qing Liu, Zehui Fang, Quan Li Li, Hai Ming Wong. Bioactive Materials.2024, DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.10.022.
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