摘要：疫苗是人类历史上最重要的发明之一，已经彻底改变了全球健康。通常，疫苗通过触发先天免疫反应和刺激抗原呈递细胞，引发针对特定病原体抗原的防御性适应性免疫反应。作为关键要素，佐剂通常是作为添加剂使用的化学材料，以增加疫苗的效力和免疫原性。90多年来，佐剂一直是许多人类疫苗中不可或缺的组成部分，通过增强、调节和延长免疫反应来提高其效力。在这里，我们及时并全面地回顾了佐剂的历史发展和当前状态，包括它们的分类、作用机制以及在不同疫苗中的角色。此外，我们对当前的许可流程进行了系统分析，并重点介绍了涉及疫苗佐剂的临床试验中的显著例子。展望未来，我们预测该领域的未来趋势，包括新佐剂配方的开发、创新佐剂的创造以及它们在系统疫苗学和疫苗递送更广泛范围内的整合。文章认为，对生物化学、材料科学和疫苗免疫学的更深入理解对于推进疫苗技术至关重要。这些进步预计将导致未来开发出更有效的疫苗，能够对抗新兴传染病并增强公共卫生。
1.引言：疫苗佐剂的历史
自20世纪初以来，疫苗佐剂研究领域取得了显著进展（图1）。随着传染病的日益流行，免疫接种已成为限制其传播和减少相关伤害的最有效方法。然而，早期疫苗往往证明是无效的，因为纯化的抗原本身无法引发足够强烈的免疫反应。为了克服这一挑战，引入了佐剂的概念。佐剂是添加到疫苗中以增强其免疫原性，从而提高其效力的材料。
现代佐剂的发展一直是一个缓慢而充满挑战的过程。研究人员旨在创造能够引发强烈免疫反应的同时保持安全性的疫苗。这涉及到选择性地结合明确定义的分子和配方，并探索天然和合成化合物。正如图1所总结的，佐剂的组成随着时间的推移而演变。它已经从早期的天然成分发展到当代的合成化合物。
尽管佐剂开发面临挑战，但目前有超过30种来自不同制造商的许可疫苗含有佐剂。铝盐是最早发现的佐剂，已被发现可以增强针对乙型肝炎、破伤风、白喉、百日咳和人类乳头瘤病毒等疾病的疫苗的免疫反应。铝盐的有效性归因于它们能够在注射部位形成仓库、诱导炎症以及激活树突细胞和T细胞等因素。尽管铝盐在疫苗中使用了七十多年，但其确切的免疫机制仍然不完全了解。
1990年代后期的佐剂发展包括油包水乳液。这些乳液有助于抗原在较长时间内缓慢释放，激活先天免疫系统，并诱导体液和细胞免疫反应。这种乳液的首次使用之一是在Fluad中，Fluad是一种针对65岁以上成人的许可季节性流感疫苗。其他FDA许可的佐剂包括MF59（一种含有角鲨烯、一种可生物降解油和表面活性剂的油包水乳液佐剂，用于流感疫苗）和AS03（由α-生育酚、角鲨烯和表面活性剂组成，用于H1N1流感疫苗和一些大流行流感疫苗）。AS01（一种脂质体和单磷酰脂A的混合物）已在RTS,S/AS01疟疾疫苗和带状疱疹疫苗Shingrix中使用。
尽管许多其他佐剂在临床前模型中显示出高效力，但由于安全或耐受性问题，大多数尚未获得人类使用的许可。此外，包括铝、MF59和佐剂系统AS0佐剂在内的现有佐剂在人类中的作用分子机制仍然不甚了解。
2.佐剂的好处和效果
总体而言，疫苗佐剂在增强疫苗的有效性和可及性以及减轻全球传染病负担方面发挥着关键作用。它们的用途和其他实际应用如下（图2）：
1.缓解有限的疫苗供应：佐剂增强免疫反应，允许较少的疫苗剂量实现完全保护。这减轻了卫生系统的负担，并增加了无法接受多剂疫苗的人的可及性。佐剂还可以降低疫苗中必要的抗原剂量，从而可能减少副作用并增加可用性。例如，重组疫苗在制造上具有显著优势，但通常自身免疫原性较弱。将佐剂与重组大流行流感蛋白结合可以大幅减少实现目标抗体水平所需的抗原量，从而显著增加制造能力。例如，AS03是一种油包水乳液佐剂，已在H1N1流感疫苗等疫苗中使用。它已被证明可以改善免疫反应并允许抗原节约，这意味着可以使用更少的疫苗抗原量，同时仍然产生强烈的免疫反应，这有助于延长现有疫苗供应。
2.促进快速免疫反应：佐剂刺激对疫苗抗原的更强、更持久的反应，提供更好的保护。例如，将AS04佐剂添加到GSK的乙肝抗原Fendrix中，使得三剂方案减少到两剂。例如，Advax是一种基于delta菊粉的佐剂，已被证明可以加速免疫反应。它激活先天免疫系统，并促进细胞因子和趋化因子的产生，这有助于增强适应性免疫反应。
3.扩大抗体反应：佐剂扩大了对具有显著抗原漂移或株变体的病原体的抗体反应，这对于流感、人类乳头瘤病毒（HPV）和疟疾寄生虫等疾病至关重要。例如，MF59是一种已被证明可以增强细胞和体液免疫反应并显著增加抗体滴度和改善抗体反应质量的油包水乳液佐剂。
4.增强抗体反应的幅度和功能性：佐剂不仅增加了抗体反应的幅度，还增加了它们的功能性、亲和力或免疫系统产生的功能性抗体数量。例如，AS04是一种将铝盐与单磷酰脂A（MPLA）结合的佐剂，MPLA是一种Toll样受体4激动剂。AS04已被证明可以增强抗体反应的幅度和功能性。它促进了高质量抗体的产生，包括增加抗体滴度和改善抗体亲和力和亲和力。
5.增强T细胞反应：正在开发新的疫苗候选物以改善T细胞反应，现有的人类使用批准的佐剂未能有效诱导这些反应。目标是更有效地吸引T辅助细胞，以优化抗体反应的质量和持久性，或诱导能够针对和消除细胞内病原体的效应CD4+或CD8+ T细胞。因此，新疫苗可能包括Toll样受体（TLRs）和其他先天免疫受体的激动剂，以促进T辅助细胞反应的产生。这种方法旨在克服传统佐剂的局限性，创造更有效的疫苗，能够提供更持久的保护，对抗更广泛的病原体。通过改善T细胞反应，这些疫苗也可能为免疫系统减弱的个体或对传统疫苗反应不佳的人提供好处。例如，CpG ODNs是含有特定免疫刺激性序列的合成DNA分子，作为Toll样受体9（TLR9）激动剂，已被证明能够通过促进抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的激活和分化来增强T细胞反应。它们诱导Th1型免疫反应，导致T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性T细胞活性增加。
6.开发新疫苗：佐剂在开发传统疫苗无效的疾病疫苗中至关重要，增强免疫反应并针对多种病原体株。它们可以增强对疫苗的免疫反应，并帮助针对病原体的多种株。例如，在流感疫苗的情况下，已使用佐剂来创建可以对不同流感病毒株提供更好保护的疫苗。此外，佐剂可用于开发尚未有有效疫苗的病原体引起的疾病疫苗，如HIV或疟疾。开发能够刺激针对这些病原体的强烈和针对性免疫反应的佐剂是一个重要的研究领域。例如，在病毒样颗粒（VLP）佐剂中，VLP是自组装结构，模仿病毒的整体结构但缺乏病毒遗传物质，使其不具传染性。VLP既可以作为抗原也可以作为佐剂。它们已用于新疫苗的开发，以增强免疫反应，提高疫苗效力，并扩大对不同病毒株或亚型的免疫反应。
7.提高安全性：通过增强免疫反应，佐剂可以降低疫苗相关不良事件的风险。这是因为免疫系统能够更好地针对和消除抗原，降低可能导致副作用的过度免疫反应的风险。因此，疫苗中使用佐剂已成为提高疫苗效力、安全性和可及性的重要策略。例如，病毒体是将病毒蛋白（如流感血凝素）纳入其结构的类脂质体颗粒。它们已被用作疫苗中的佐剂以提高安全性。病毒体提供了病毒的抗原特性，但没有传染性遗传物质，降低了疫苗相关不良事件的风险。病毒体佐剂已用于流感和甲型肝炎等疾病的疫苗中。
图2.佐剂的潜在好处。
3.佐剂的类别及其作用机制
在这一部分，我们讨论典型的疫苗佐剂，包括它们的组成、功能机制、在疫苗中的应用以及它们的优点和缺点，以及与它们相关的挑战。铝盐基佐剂。
铝盐基佐剂，通常称为铝佐剂，是最早用于许可的人类疫苗中的佐剂，并且仍然是使用最广泛的佐剂。它们由氢氧化铝、磷酸铝或两者的组合组成，已知能够在注射部位形成仓库，随着时间的推移缓慢释放疫苗抗原，从而产生更强和更持久的免疫反应。它们已被证明能够增强对广泛抗原的免疫反应，包括乙型肝炎、人类乳头瘤病毒（HPV）和肺炎球菌病疫苗中的抗原。由于它们经过验证的安全性记录、广泛增强免疫反应的能力以及制造的便利性，它们仍然是疫苗开发的有吸引力的选择。然而，人们对铝盐可能引起不良反应（如注射部位的局部反应和罕见的过敏反应）的潜力有一些担忧。使用铝盐作为疫苗佐剂的好处通常大于风险。
铝盐基佐剂的确切作用机制尚不完全了解，但有几种提出的理论（图4a）。铝佐剂之所以受欢迎的一个关键原因是它们能够在注射部位形成仓库。这个仓库随着时间的推移缓慢释放疫苗抗原，为免疫系统提供对抗原的长期暴露。这种长期暴露有助于增强免疫反应，导致更强大和更持久的免疫力。
此外，也认为铝佐剂通过在注射部位诱导炎症来激活先天免疫系统。这种炎症被认为是由炎症体激活触发的，炎症体是一种在先天免疫反应中起关键作用的蛋白质复合体。激活的炎症体释放促炎细胞因子，这有助于吸引免疫细胞到炎症部位并激活它们。
铝盐基佐剂还被认为是通过诱导促炎细胞因子（如IL-1β和TNF-α）的释放来激活树突细胞，这些细胞是专门呈递抗原给T细胞的免疫细胞，负责识别和攻击外来入侵者。铝盐基佐剂通过吸引树突细胞到注射部位并激活它们来激活树突细胞。反过来，树突细胞促进效应T细胞的分化，这在诱导免疫中起着关键作用。
铝佐剂还被认为是通过刺激CD4+ T细胞的分化和诱导B细胞产生抗体来刺激免疫反应，这对于诱导免疫至关重要。这一过程是通过树突细胞产生IL-1β和IL-18来介导的，它们促进效应T细胞的分化。仓库中抗原的缓慢释放也有助于延长B细胞对抗原的暴露，这可以增强抗体的产生。
总之，铝盐基佐剂通过在注射部位形成仓库、激活炎症体、诱导促炎细胞因子的释放、吸引树突细胞到注射部位以及增强B细胞的抗体产生来发挥作用。这些机制共同作用，增强疫苗中抗原的免疫反应，提高对目标疾病的保护。
3.1.无机纳米颗粒基佐剂
无机纳米颗粒基疫苗佐剂，如纳米铝、层状双氢氧化物（LDH）、纳米/介孔硅、纳米金刚石、量子点等，已被研究其增强疫苗免疫反应的潜力。无机纳米颗粒提供了一个多功能的平台，用于表面修饰，允许精确控制大小和形状参数。这种多功能性便于设计旨在引发特定免疫反应的定制结构。此外，这些纳米颗粒通常表现出强大的化学和物理化学稳定性，确保在储存和运输过程中无需冷藏即可延长货架寿命。这些属性对于实际疫苗部署和分发场景至关重要，特别是在资源有限的环境中，使它们成为储备疫苗以应对未来紧急需求的理想选择。
无机纳米颗粒基疫苗佐剂的作用机制涉及其与免疫系统的相互作用，以增强和调节疫苗中抗原的免疫反应。无机纳米颗粒作为抗原的载体，确保其有效地传递给抗原呈递细胞（APCs）。纳米颗粒被设计为被APCs（如树突细胞和巨噬细胞）有效摄取。这种摄取是通过纳米颗粒的大小、表面电荷和表面修饰来促进的。一些无机纳米颗粒佐剂，如基于铝的佐剂，会在注射部位诱导局部炎症。这吸引免疫细胞到该部位并促进APCs的招募。无机纳米颗粒佐剂有助于发展持久的免疫记忆。这确保免疫系统“记住”遇到的抗原，为后续暴露于病原体提供保护。
其中，具有纳米纤维形态的γ相氧化铝水合物（γ-AlOOH）纳米颗粒已被制备并用作人结核杆菌（HTB）水热提取物的传递系统。由于其独特的介孔纤维结构，合成的γ-AlOOH显著增强了类巨噬细胞的细胞摄取，与商业铝佐剂相比增加了约两倍。
介孔硅具有有序的多孔结构，孔径均匀在介尺度范围内（2至50纳米）。这种结构提供了大的表面积和可调节的属性，使其适合于包括药物传递和疫苗佐剂在内的各种应用。介孔硅的表面可以被修饰以定制其属性，以适应特定的疫苗配方和应用。介孔硅也可以用来封装免疫调节剂，进一步增强佐剂效果。例如，无定形硅可以用作疫苗佐剂以增强免疫反应。纳米尺度和微米尺度的硅都促进了髓样细胞中NLRP3炎症体的激活，而只有纳米尺度的硅激活了角质形成细胞中的炎症体。
LDHs是具有正电荷的类水镁石层和层间阴离子的层状材料，为包括药物传递和免疫调节在内的各种应用提供了独特的结构。LDHs由于其层状结构，为抗原提供了高负载能力。LDHs可以设计为以受控的方式释放抗原，促进持久和持久的免疫反应。LDHs可以表面修饰以整合额外的功能，如靶向配体或免疫调节剂，以进一步定制其性能。
总之，无机纳米颗粒基作为疫苗佐剂是一个活跃的研究领域，它们在疫苗开发中的应用有望增强免疫反应，提高疫苗的整体有效性。
3.2.乳液佐剂
当两种无法形成均匀混合物的液体混合在一起时，就会形成乳液。抗原包含在这些水滴中，油作为仓库，缓慢释放抗原，并通过减少清除时间来增强免疫反应，延长抗原暴露。乳液是另一种已开发用于增强疫苗免疫反应的疫苗佐剂。乳液由两种不相混溶的液体组成，通常是一个油相和一个水相，由表面活性剂稳定。乳液通过在油相中形成小滴的抗原，然后将它们分散在整个水相中来工作。
最早被批准用于人类疫苗的油包水佐剂之一是MF59，它包含角鲨烯、聚山梨酯80、三油酸甘油酯和柠檬酸钠脱水物。MF59诱导ATP释放，并上调细胞因子和趋化因子，以增强接种部位的抗原特异性免疫反应。它已被证明是安全且耐受性良好的。另一种基于油包水乳液的佐剂是AS03，它含有表面活性剂聚山梨酯80和两种可生物降解的油，角鲨烯和DL-α-生育酚。欧洲委员会在2009年授予AS03佐剂的Pandemrix市场授权，AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗在2013年获得了FDA的许可。AS03已越来越多地用于流感和疟疾疫苗。
乳液已在各种疫苗中使用，包括流感、乙型肝炎和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗。它们提高了疫苗效力，特别是在对传统疫苗可能反应不佳的人群，如老年人或免疫受损个体中。乳液佐剂通过几种机制增强疫苗的免疫反应。图4b41中提出了几种理解基于乳液的佐剂如何工作的机制：
一个主要机制是抗原在较长时间内缓慢释放。乳液滴的小尺寸允许延长表面积与体积比，这增强了抗原呈递和抗原呈递细胞的摄取。这种缓慢释放的抗原可以在较长时间内激活免疫系统，从而产生更强大和持久的免疫反应。
乳液佐剂还激活先天免疫系统。乳液滴被免疫系统识别为外来物质，导致激活树突细胞、巨噬细胞和单核细胞等抗原呈递细胞。然后这些细胞产生促炎细胞因子和一系列趋化因子，如TNF-α和IL-1β，这进一步激活免疫系统并吸引免疫细胞到注射部位，形成一个免疫能力环境，以增强抗原运输到引流淋巴结。
乳液佐剂的另一个重要机制是它们能够诱导体液和细胞免疫反应。乳液滴可以被抗原呈递细胞摄取，然后呈递给T细胞和B细胞。T细胞负责直接攻击感染的细胞，而B细胞产生可以中和病原体的抗体。已证明乳液佐剂可以激活T细胞和B细胞，导致更全面的免疫反应。
总之，乳液佐剂已成为疫苗开发中的重要工具。它们通过几种机制增强疫苗的免疫反应，包括缓慢释放抗原、激活先天免疫系统，并诱导体液和细胞免疫反应。
3.3.Toll样受体（TLR）激动剂
Toll样受体（TLRs）是一种模式识别受体，对入侵病原体的先天免疫反应起着至关重要的作用。TLRs是跨膜受体，主要由先天免疫系统的细胞表达。这些受体分为两组：细胞表面TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6）和细胞内TLRs（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9），它们在内体膜上表达。每个TLR都包含一个跨膜域、一个富含亮氨酸的重复（LRR）段，该段识别与病原体相关的分子模式（PAMPs）和与损伤相关的分子模式（DAMPs），以及一个Toll/白细胞介素-1受体（TIR）域，该域启动下游信号传导并诱导炎症反应。因此，TLRs是佐剂刺激有效免疫反应的有吸引力的靶标，为病原体提供持久保护。Toll样受体（TLR）激动剂作为疫苗佐剂在对抗癌症、艾滋病和疟疾等致命和复杂疾病方面非常有前景。
CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）是具有磷酸硫酯骨架的合成DNA分子，包含未甲基化的CpG基序。图4c描述了基于TRL的佐剂如何作用：CpG ODN是一种强效佐剂，诱导1型辅助T（Th1）反应，并促进细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。CpG ODN通过TLR9激活增强了对抗原的特异性体液和细胞免疫反应。由于其独特的特性，CpG ODN可以用作通过肌肉内、皮下、口服和鼻内途径进行免疫接种的佐剂。作为有效的疫苗佐剂，CpG ODN可以促进抗原的免疫刺激效应，激活抗原呈递细胞（APCs），并加速免疫反应。CpG ODN有助于浆细胞样树突细胞（pDCs）上主要组织相容性复合体（MHC）、CD40和CD86的表达，并增强抗原处理，导致强大和持久的免疫反应。
3.4.脂质体
脂质体是一种疫苗佐剂，由磷脂和胆固醇组成，是能够包裹抗原和其他免疫刺激性分子的小球形结构。它们是可生物降解的、生物相容的，并且允许进行多功能的结构修饰，以实现可调节的特性和毒性。脂质体可用于将抗原传递给抗原呈递细胞，如树突细胞，这可以激活免疫系统。此外，脂质体能够增强体液和细胞免疫反应，诱导对清除细胞内病原体和增强抗体反应很重要的Th1偏向反应，使它们成为疫苗开发的有吸引力的佐剂。脂质体的一个独特特性是它们能够被修改以针对特定的细胞类型。它们可以被修饰有针对树突细胞上特定受体的抗体或肽，增加脂质体包裹的抗原的摄取。脂质体也可以用来共同传递多个抗原或免疫刺激性分子，从而引发更强大的免疫反应，特别是对于可能需要多个抗原来诱导保护性免疫反应的复杂病原体。
基于脂质体的佐剂系统AS01包含两种免疫刺激性剂，3-O-去酰基-4'-单磷酰脂A（MPL）和QS-212。使用AS01佐剂的疫苗包括新开发的疟疾疫苗RTS, S（Mosquirix），以及针对带状疱疹（HZ/su）、HIV和结核病的疫苗候选物。AS01可以促进产生针对抗原的抗体和针对抗原的CD4+ T细胞，这使其区别于其他佐剂。
3.5.其他佐剂
细胞因子 - 细胞因子是一类在免疫反应中起重要作用的信号分子。它们由免疫系统的各种细胞分泌，作用于特定受体以介导一系列生物学功能，如炎症、细胞增殖和分化。细胞因子可以根据其结构和功能被划分为不同的类别，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子。
聚合物 - 聚合物是由通过共价键连接在一起的重复单元组成的化合物。它们可以是天然的或合成的，并且在材料科学、医学和生物技术中有广泛的应用。在疫苗方面，聚合物可以用作载体，创建缓慢释放的仓库，在其大的交联结构中携带抗原和其他免疫调节剂。这导致持续的抗原呈递和免疫系统的激活，可以导致更强大和更持久的免疫反应。
皂苷 - 皂苷是具有两性属性的天然化合物，意味着它们既有亲水区也有疏水区。它们在传统医学中已被使用数个世纪，并且有许多潜在的药物应用，包括作为疫苗的佐剂。皂苷可以通过刺激树突细胞等抗原呈递细胞以及促进细胞因子和趋化因子的产生来增强免疫反应。皂苷基佐剂的一个例子是QS-21，它与MPL（单磷酰脂A）一起在AS01佐剂系统中使用。AS01是一种有效的佐剂，已被用于开发针对疟疾、结核病和带状疱疹等疾病的疫苗。
病毒体 - 病毒体由磷脂和病毒包膜蛋白组成，通常来源于不引起人类疾病的病毒。病毒包膜蛋白提供了可以激活免疫系统的免疫原性表面，而磷脂有助于稳定病毒体结构并增加其被抗原呈递细胞的摄取。
4.各种疫苗及其佐剂的作用
在这一部分，我们讨论了佐剂在各种疫苗中的作用。图5总结了当前正在开发的已确认的主要疫苗和方法。这些包括全病毒疫苗（如活减毒疫苗、灭活疫苗和病毒载体疫苗）、亚单位疫苗和核酸疫苗（包括pDNA和mRNA）。
图5.各种疫苗及其佐剂的总结。
4.1.灭活疫苗
灭活疫苗通常由病毒感染的细胞制成并灭活，这确保了病毒不再具有传染性，但保留了它们的抗原特性，使它们有助于产生免疫反应。可以向灭活疫苗中添加佐剂以增强免疫反应。氢氧化铝和磷酸铝等铝盐是灭活疫苗中最常用的佐剂。它们通过将抗原吸附到其表面来增强免疫反应，这允许抗原缓慢释放并在较长时间内刺激免疫系统。灭活疫苗中使用的其他佐剂包括MF59、AS03和AS04。MF59是一种油包水乳液，通过在注射部位创建抗原仓库以及刺激先天免疫系统来增强免疫反应。这些佐剂已在H1N1流感疫苗和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗等疫苗中使用。在一项研究中，带有铝佐剂的CoronaVac灭活疫苗对SARS-CoV-2显示出高效的中和效果。
4.2.活减毒病毒疫苗
活减毒病毒疫苗由于其在注射后能在宿主体内迅速扩增，从而有效免疫，因此已成为成功的免疫策略。活减毒病毒疫苗是病毒的弱化形式，能在体内复制但不引起疾病。因此，它们可以引发强烈且持久的免疫反应。通常不与活减毒病毒疫苗一起使用佐剂，因为疫苗本身已经是免疫系统的强刺激剂。然而，一些研究已经探索了与活减毒病毒疫苗一起使用佐剂以潜在增强其有效性的可能性。一个例子是使用油包水乳液MF59作为活减毒流感疫苗的佐剂，已被证明可以改善老年人的免疫反应。然而，需要更多的研究来确定活减毒病毒疫苗中佐剂的安全性和有效性。
4.3.病毒载体疫苗
复制能力和非复制能力的腺病毒载体通常用于表达其他病毒蛋白的抗原以进行免疫接种。佐剂可以与病毒载体疫苗一起使用，以增强疫苗产生的免疫反应。例如，牛津-阿斯利康COVID-19疫苗是一种病毒载体疫苗，它使用一种减毒的黑猩猩腺病毒来传递SARS-CoV-2刺突蛋白的遗传物质。这种疫苗含有一种名为AS03的佐剂，这是一种由角鲨烯（一种天然油）、聚山梨酯80（一种洗涤剂）和维生素E组成的混合物。
4.4.病毒样颗粒疫苗
在这种策略中，结构病毒蛋白被共同表达以形成非感染性颗粒作为疫苗免疫原。它们类似于真正的病毒颗粒，但缺乏病毒基因组。在细胞中生产VLPs，然后进一步重建为稳定和免疫原性形式是一个多阶段过程。佐剂可以用于病毒样颗粒疫苗中，以增强免疫反应并提高疫苗效力。用于病毒样颗粒疫苗的常见佐剂包括铝盐、MF59（一种油包水乳液）和CpG寡核苷酸（TLR-9激动剂）。这些佐剂刺激免疫系统产生对VLP疫苗更强大和更持久的反应。在某些情况下，VLP本身可以作为佐剂，因为它已经显示出通过多种途径刺激免疫系统。总体而言，VLP疫苗中佐剂的使用可以帮助增加其效力，减少所需剂量，并提高疫苗覆盖率。
4.5.DNA疫苗
基于DNA的疫苗使用DNA质粒作为载体，将编码抗原的基因转移到宿主细胞中，特别是抗原呈递细胞。这些疫苗的机制依赖于将遗传物质传递到细胞核中，激活载体中的哺乳动物启动子，并通过宿主细胞机制启动目标基因的转录。然而，与其他疫苗类型相比，DNA疫苗通常具有有限的免疫原性，这可能限制了它们的有效性。佐剂可以通过增强对编码抗原的免疫反应来帮助克服这一限制。在DNA疫苗中测试了各种佐剂，包括铝、CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）和脂质体。铝已被证明可以增强小鼠对DNA疫苗的免疫反应，但在人类试验中的成功有限。CpG ODNs是模拟细菌DNA的合成分子，可以通过与免疫细胞上的Toll样受体（TLRs）相互作用来激活免疫系统。脂质体是小的脂质囊泡，可以包裹DNA和佐剂，并直接传递给抗原呈递细胞。基于脂质体的佐剂在DNA疫苗的临床前研究中显示出前景。
4.6.mRNA疫苗
mRNA疫苗涉及将mRNA分子直接注入宿主细胞中，然后在细胞质中翻译成目标蛋白。这些疫苗通常包含一个带有3'聚腺苷酸尾的开放阅读框（ORF），可以刺激细胞和体液免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA疫苗提供了许多优势，如安全性、灵活性、可扩展性和成本效益。mRNA疫苗通常不需要佐剂，因为mRNA分子本身就会刺激免疫系统。例如，针对COVID-19的mRNA疫苗使用脂质纳米颗粒传递系统来保护mRNA并促进其进入细胞，但这种传递系统在传统意义上不被视为佐剂。然而，一些研究正在进行中，以探索在mRNA疫苗中使用佐剂以增强其有效性，特别是对于可能对疫苗有较弱免疫反应的某些人群，如老年人。
4.7.基于蛋白质亚单位的疫苗
基于蛋白质亚单位的疫苗仅包含来自病原体的特定蛋白质或蛋白质，而不是整个病原体。佐剂通常与基于蛋白质亚单位的疫苗一起使用，以通过增加对蛋白质抗原的免疫反应来增强其有效性。铝盐（如氢氧化铝）是最常用的基于蛋白质亚单位疫苗的佐剂，因为它们已被证明可以增强对抗原的抗体反应。其他佐剂，如MF59（油包水乳液）、AS03（角鲨烯油包水乳液）和AS04（氢氧化铝和MPL），也已用于基于蛋白质亚单位的疫苗中以提高其免疫原性。此外，正在研究使用Toll样受体激动剂等新型佐剂与基于蛋白质亚单位的疫苗一起使用，以进一步增强其免疫反应。
5.疫苗佐剂的临床试验和许可
开发含佐剂的疫苗是一项艰巨的任务，可能需要数年时间，因为必须确保疫苗的每个组分单独和组合使用时都兼容。美国食品和药物管理局生物制品评估和研究中心（CBER）发布了一份指南，以促进新疫苗配方的开发，以应对开发针对传染病疫苗的紧迫需求。指南建议从使用适当的动物模型进行临床前测试开始，以评估配方（包括佐剂）的安全性和免疫原性，以及佐剂对免疫反应的影响。必须包括单独的佐剂和抗原对照组，以提供佐剂效应的证据。免疫原性评估可能包括体液和细胞反应，如果疾病有动物模型，可以获得初步的保护效力信息。在临床前测试和疫苗配方的良好生产规范（GMP）生产之后，开始人体临床试验。I期研究评估健康个体的安全性和剂量，获得初步的免疫原性信息。IIa期试验涉及数百名志愿者，以评估免疫原性、耐受性和安全性。当测试进入IIb/III期时，重点是确定疫苗目标人群中的免疫原性和效力，随着参与志愿者人数的增加，研究持续时间也在增加。
确认疫苗的安全性和有效性后，疫苗可以获得许可并上市销售。然而，疫苗在IV期进行上市后安全监测，以评估其他罕见的不良反应。这些活动的目的是确保根据安全监测的结果采取适当的行动。监管机构严格应用药物警戒流程，以评估许可后出现的潜在安全信号。然而，评估试图建立与疫苗接种因果关系的研究所可能是复杂的和不确定的，尽管许可后有大量安全信息。
在某些情况下，疫苗在获得许可后因证实疫苗与不良事件之间存在因果关系或因效力不佳改变了收益-风险比而被撤回。虽然也有一些例子表明疫苗接种与不良事件之间的所谓因果关系被证明是没有根据的。疫苗制造商和监管机构在安全信号监测或报告新的重要不良事件时采取迅速行动。他们将证据迅速传达给医疗专业人员和公众，以便对最新的收益-风险概况做出明智的决策。
6.疫苗佐剂的临床试验示例
6.1.乳液
MF59是开发能够引发针对HIV的体液和细胞免疫反应的疫苗的一个例子，这对于预防HIV感染是理想的。在一项I期临床试验中，研究了DNA初免后用重组包膜糖蛋白加MF59佐剂增强的联合疫苗方案在未感染HIV的成年人中的安全性和免疫反应。此外，正在II期临床试验中评估含和不含MF59佐剂的灭活流感A/H9N2疫苗在门诊成人中的安全性。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种已在临床研究中调查的水包油乳液佐剂。它们具有不同的油水比率。Montanide ISA 51已在古巴的疟疾疫苗I期和流感疫苗II期研究中进行了评估，并已在古巴获得治疗性肺癌疫苗的许可。Montanide ISA 720已在疟疾疫苗的II期临床试验中进行了测试。这两种佐剂都已被证明可以促进有效的免疫反应，特别是增强特定的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，观察到短暂的副作用，如发烧、头痛或类似流感的症状，尽管两者似乎都能很好地耐受。AS03佐剂在赛诺菲H1N1流感疫苗中在健康成人和老年人群不同剂量水平下进行了测试，以了解身体对不同强度的H1N1流感疫苗的反应，无论是单独使用还是与“佐剂”一起使用。
6.2.基于铝的佐剂
在一项I期临床试验中，评估了单剂量默克0657nI金黄色葡萄球菌疫苗加或不加默克铝佐剂的安全性、耐受性和免疫原性。此外，还评估了MN重组可溶性gp120/HIV-1（MN rsgp120/HIV-1）与QS21有或无铝佐剂结合使用的安全性和免疫原性。
6.3.基于脂质的佐剂
脂质材料自发现其独特的囊泡结构非常适合包裹各种生物活性物质（如DNA和脂肪酸）以来，一直被用作疫苗佐剂。在早期，科学家专注于脂质A，这是LPS的疏水锚，被认为是一种有效的佐剂，可以显著增加体液和细胞免疫反应。然而，由于其高毒性，基于脂质A的佐剂被认为不适合人类疫苗。相反，GLA-SE和GLA-AF都是脂质A类似物，被发现在增强对H5N1的保护方面特别有效，毒性低，副作用有限。GLA-AF也已作为乳液在许多疫苗中作为替代品进行了测试，最值得注意的是在大流行流感中。
6.4.基于Toll样受体（TLR）激动剂的佐剂
TLR3激动剂Poly-ICLC已在治疗黑色素瘤患者的佐剂疫苗安全性研究中进行了研究。这是一项I期开放标签剂量递增研究，研究TLR3激动剂Poly-ICLC作为高风险黑色素瘤患者NY-ESO-1蛋白疫苗的佐剂。佐剂疫苗治疗的目标是训练内源性免疫系统识别和靶向最小残留疾病。
6.5.皂苷
基于皂苷的OPT-821已在三价神经节苷脂在临床III期试验中用于无病生存的肉瘤患者。如果三价疫苗能刺激患者的免疫系统产生识别和靶向GM2、GD2和GM3糖的抗体，那么患者的抗体可能会攻击并杀死任何剩余的肉瘤细胞，从而可能预防肉瘤的复发。MatrixMTM也在大流行流感和RSV疫苗的I期和II期临床试验中进行了测试，显示出安全且耐受性良好，增强了体液和细胞免疫反应。其他基于皂苷的佐剂，如QS-21，已在癌症疫苗和传染病疫苗的临床试验中进行了评估，并显示出能诱导强烈的免疫反应并提高疫苗效力。然而，它们的复杂结构和可变组成可能会影响它们的一致性和可复制性，它们的潜在毒性和溶血活性需要在临床前和临床研究中仔细评估。
6.6.核苷酸
CpG ODN、dsRNA和IL-12 DNA等佐剂成分是激活模式识别受体（PRRs）以刺激免疫反应的核苷酸基佐剂的例子。例如，dsRNA可以分泌IFN-a和IFN-c等细胞因子，通过TLR3、MDA-5和NLRP3炎症体信号传导，目前正在进行流感和狂犬病疫苗的临床试验。用IL-12 DNA佐剂的DNA疫苗被引入以提供针对广泛HIV变体的有效保护，最近的试验表明它们耐受性良好，可以增强免疫反应。Pika佐剂是另一种核苷酸基佐剂，是稳定的卡那霉素和钙的dsRNA合成类似物，促进干扰素、IL-2和IL-12的产生。这种佐剂可以将主要产生体液免疫的预防性疫苗转变为具有强大细胞免疫的治疗性疫苗。
6.7.细胞因子
在最近的研究中，分子佐剂已被证明能有效刺激免疫反应，特别是在亚单位疫苗中。例如，IL-2和GM-CSF等细胞因子已在针对口蹄疫的疫苗中进行了研究，GM-CSF目前正在评估用于乙型肝炎和HIV疫苗。其佐剂效应归因于其促进巨噬细胞分化和增殖，以及激活抗原呈递细胞的能力。同样，IL-12和IL-15作为佐剂在一项正在进行的I期临床试验的HIV疫苗中被使用。这些细胞因子已证明能够刺激NK细胞和T细胞的增殖。
6.8.病毒体
病毒体是包膜病毒样颗粒，已在欧洲获得许可，用于针对甲型肝炎和流感的疫苗，并已在恶性疟原虫疟疾和慢性丙型肝炎疫苗的临床试验中使用。
6.9.肽
肽，MUC1-聚ICLC疫苗正在II期试验中进行测试，旨在评估在因有晚期腺瘤病史而增加结直肠癌风险的受试者中，MUC1疫苗的抗体和T细胞反应。MUC1-聚ICLC疫苗正在开发中，以防止息肉发展成结直肠癌，并防止息肉复发，这有助于体内免疫系统识别MUC1的变化，这些变化伴随着向癌症的进展，并消除产生异常的细胞。
6.10.其他
其他形式的佐剂也在临床试验中进行调查。一项I期临床研究针对研究性的PIKA（基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐剂）狂犬病疫苗，包括灭活和纯化的狂犬病病毒和PIKA佐剂，以评估疫苗组合在健康成年志愿者中的临床安全性，并根据加速疫苗接种方案评估疫苗的效力。Mayo Clinic与Agri-King Corporation联合开发了一种新型合生元AKSB（Agri-King合生元）。一项针对正常人类志愿者（65岁以上）的AKSB的I期安慰剂对照试验，旨在研究当患者同时接受流感疫苗时，这种益生菌的安全性。磷酸钙，以羟基磷灰石的形式，已在法国获得许可，用于白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗。磷酸钙被认为是人体内的天然化合物，耐受性良好，使其成为可能替代铝佐剂的潜在替代品，铝佐剂可能会产生不良副作用。细菌鞭毛蛋白，TLR5的配体，也显示出可导致混合Th1和Th2反应的佐剂效应。在临床试验中，双价P. aeruginosa鞭毛蛋白佐剂疫苗帮助囊性纤维化患者降低了感染P. aeruginosa的风险。多糖是另一种潜在的佐剂，可以增强疫苗的免疫反应，并促进细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。还有一些新型佐剂结合了上述几种佐剂，有效成分协同作用以产生最佳的免疫反应。
7.针对COVID-19的疫苗佐剂
COVID-19大流行突显了开发安全有效疫苗以控制SARS-CoV-2病毒传播的需求。开发理想的疫苗需要广泛的研究和资源，以确保其满足当前形势的需求。疫苗旨在诱导保护性免疫反应，可以预防或减轻病毒感染的严重程度。
7.1.COVID-19疫苗中佐剂的好处
在COVID-19疫苗中使用佐剂有几个原因/动机：1)一个有效的COVID-19疫苗的主要要求之一是其能够刺激强大的免疫反应，能够产生高水平的中和抗体。为了实现这一点，疫苗可能需要多剂或佐剂。佐剂可以帮助减少疫苗中所需的抗原量，从而降低其成本。2)在SARS-CoV-2疫苗中结合适当的佐剂可以通过减少产生保护性免疫反应所需的抗原量来满足这些要求。疫苗的生产和分发应该是成本效益高且可扩展的，以满足压倒性的需求。鉴于大流行影响全球大多数国家，迫切需要一种可以快速高效生产和分发的疫苗。3)此外，佐剂还可以通过提供持久的免疫反应并扩大其对病毒不同株的保护范围来增强疫苗的效力。因此，针对COVID-19的佐剂疫苗的研发对于开发安全、有效和成本效益高的疫苗以控制大流行至关重要。
7.2.针对Covid-19的许可佐剂和候选物
NVX-CoV2373是Novavax开发的一种有前景的疫苗候选物，用于预防COVID-19。它是一种基于蛋白质的疫苗，使用引起COVID-19的SARS-CoV-2病毒的遗传序列创建。S蛋白是COVID-19疫苗的关键靶标，因为它是病毒附着和感染人类细胞的主要手段。为了增强免疫反应并刺激高水平的中和抗体，NVX-CoV2373与Novavax的专利基于皂苷的Matrix-M™佐剂配方。这种佐剂经过广泛测试，并通过刺激抗原呈递细胞进入注射部位并在局部淋巴结中增强抗原呈递，从而增强免疫反应，表现出强大且耐受良好的效果。这种基于蛋白质的疫苗候选物旨在教会免疫系统如何识别和对抗SARS-CoV-2病毒，提供针对COVID-19的保护。临床试验表明，NVX-CoV2373在预防COVID-19方面非常有效，总体有效性超过90%。获批后，NVX-CoV2373在抗击COVID-19中可能发挥关键作用，特别是在其他疫苗可能不太容易获得或有效的地区。世界各地已授权紧急使用几种COVID-19疫苗，其中一些使用了佐剂。例如，阿斯利康COVID-19疫苗使用了MF59佐剂，这是一种油包水乳液角鲨烯油，以增强疫苗的免疫反应。科兴COVID-19疫苗使用了铝佐剂，这是一种有助于增强免疫反应的铝盐。
图6.疫苗开发的演变阶段。
8.新疫苗佐剂的新兴发展
8.1.新型佐剂的设计原则
为了开发有效的佐剂疫苗，了解佐剂的工作原理并遵循一些设计原则是很重要的。问题导向原则涉及考虑四个主要问题：(1) 预防特定病原体引起的疾病所需的免疫反应类型，(2) 能够诱导所需免疫反应的相关先天免疫细胞，(3) 这些先天细胞亚群在体内的定位，以及 (4) 这些细胞上模式识别受体（PRRs）的表达。基于这些问题，在设计疫苗佐剂时需要考虑四个步骤。首先，应确定疫苗效力所需的免疫效应元素类型。这应考虑抗原类型、目标细胞亚群和表型以及免疫途径，以指导传递系统和免疫刺激剂的选择。由于PRRs是产生有效疫苗生成的关键靶标，因此在设计疫苗佐剂时，评估相关先天免疫细胞在体内的定位和目标细胞上的PRR表达非常重要。不同的PRR信号通路可能被用来开发针对不同侵害的定制反应。其次，应基于对免疫识别和保护的分子机制的理解来确定合适的疫苗抗原。合适的抗原还应能够在目标人群中实现疫苗诱导的反应定位。此外，疫苗必须向适当的细胞群体呈现足够数量的正确构象的抗原，以诱导免疫反应保护，同时考虑诱导炎症反应的耐受性和安全性问题。第三，佐剂需要一个传递系统，无论是合成的还是天然的。这需要设计感兴趣的抗原的适当传递方式，结合相关的免疫刺激剂。第四，疫苗和佐剂的制备过程应该简单。例如，如果不需要特殊的乳化剂，生产过程就更简单。如果佐剂与抗原的比例低，可能会增加疫苗改进的范围。
8.2.新型疫苗的佐剂配方
已经为已许可产品中的佐剂建立了几种配方方法。这些包括用作吸附剂的不溶性铝盐、易于注射的低油含量、油包水乳液和脂质体传递系统。虽然成分不同，但这些系统在结构上有一些显著的相似之处，它们都是作为纳米颗粒制造的。此外，这些系统可以作为抗原和免疫增强剂（包括TLR激动剂）的有效“传递系统”。适当选择佐剂的免疫刺激剂和配方成分对于诱导针对控制目标病原体的适当免疫反应至关重要。同一免疫调节分子的不同配方可能会诱导显著不同的免疫反应，如在疟疾疫苗计划中所示。例如，与AS02配方的RTS,S疫苗候选物保护了七个疫苗接种者中的六个免受感染，而相同的抗原与AS03或AS04配方的保护率分别为七个中的两个或八个中的一个。为了构建改进的佐剂，确保每个组分都是必要的并增加明确的价值，同时不引入重大的不合理责任至关重要。AS01是目前最成功的许可产品中包含的佐剂，对带状疱疹的有效性>97%。AS01佐剂的开发基于两个关键组分，MPL和QS-21，当一起使用时会产生先天激活的协同作用。这种协同作用无法通过任一分子单独实现，并且开发了一种脂质体传递系统，将两种免疫增强剂共同传递给相同的免疫细胞群体。此外，脂质体配方在减少QS-21诱导显著局部和系统反应原性方面也有效。然而，新型系统疫苗学方法可以用来识别新的佐剂途径和配方，这些可以用来设计下一代佐剂。
8.3.推进系统疫苗学
Bali等人提出了一种基于系统疫苗学的跨学科方法，以加速临床中佐剂的发现和开发，该方法涉及早期使用人类研究来生成“组学”数据，这些数据可以用来制定关于候选佐剂如何刺激强大和持久的抗原特异性T和B细胞反应的新假设。然后可以在动物模型中重新测试这些假设，随后得到的机制见解可以用来设计新的佐剂概念。所提出的佐剂开发框架更加强调在它们的发展管道早期（0/I期）在小型临床试验中测试许多潜在的佐剂概念，这可以快速测试新的佐剂并使用系统疫苗学方法获得机制见解。此外，系统疫苗学方法可以用来定义佐剂的作用机制，以及配方的作用机制、疫苗接种后不久发生的不良反应的潜在机制，以及疫苗传递的最佳配方的合理设计。总体而言，这种基于系统疫苗学的跨学科方法有潜力转变佐剂的科学并振兴新型佐剂的开发，以用于疫苗。
8.4.非侵入性疫苗传递
非侵入性疫苗传递的研究是一个关键焦点，可能对全球大规模疫苗接种活动产生重大影响。开发安全、有效和低成本的疫苗配方和佐剂，以产生期望的免疫反应和长期免疫，是一个优先事项。广泛的研究已经导致了几个新型佐剂的开发，这些佐剂目前正在临床试验中评估或已获得许可。一个研究重点是开发含有脂质的安全并提高非侵入性传递的疫苗效力的佐剂。然而，关于佐剂分子刺激后细胞表面受体之间的相互作用以及这些佐剂与现有或新型配方的兼容性，还需要更多信息。随着我们对免疫保护所涉及的分子机制的理解的提高和合成化学新方法的发展，预计疫苗开发将取得突破。新技术开发，如新的糖苷缀合方法、反向疫苗学和下一代测序技术，应该会导致针对HBV、百日咳毒素、莱姆病和HPV等疾病的新型疫苗策略，无论是否使用佐剂。研究界旨在通过引入新的免疫刺激剂和结合效力、持久记忆免疫反应和安全性的新型传递系统，确保高水平的广泛保护。这种新方法将不再仅仅依赖于结构疫苗学，因为目标表位的变异性和新病原体和肿瘤抗原的不断出现。
9.结论和展望
佐剂在近一个世纪的疫苗开发中发挥了至关重要的作用，增强了免疫原性。最初，佐剂的选择大多是经验性的，但最近的进展已经导致了更有针对性和合理的方法。对免疫系统的更深入理解使得开发更有效的疫苗配方成为可能。本综述概述了疫苗中使用的佐剂，从传统疫苗到COVID-19疫苗，重点关注它们的类型、对免疫反应的作用机制以及在疫苗配方中的作用。这些见解为选择适合传统和冠状病毒疫苗的佐剂奠定了基础。
了解各种佐剂对免疫反应的影响、它们与不同抗原类型和疫苗平台的协同作用，以及对这些佐剂的全面分析，将有助于选择提供必要免疫保护的佐剂。像基于铝的盐、TLR激动剂、乳液以及其他新型选项等佐剂具有独特的物理化学属性，显著影响免疫反应的强度、持续时间和类型。这些新型佐剂已经增强了流感疫苗和乙型肝炎和HPV疫苗。
随着COVID-19等新兴疾病的持续挑战和寻找更明确的治疗方法，开发安全有效的疫苗至关重要。更有信息的佐剂和抗原选择不仅能够增强对传统疫苗反应不佳的人群的保护，而且还可以开辟预防应用之外的新途径。这种方法在应对当前和未来的全球健康挑战中可能至关重要。
