Advanced Science:胃癌类器官中的超级增强子激活主转录因子NR3C1表达并促进对5-FU的耐药性

胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，尤其在中东和亚洲国家。尽管化疗在晚期胃癌的综合治疗中占据重要地位，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）作为化疗的基本药物，其疗效并不理想，许多患者对5-FU基化疗的反应较差。这种对5-FU的低敏感性与肿瘤细胞的代谢酶、转运蛋白等内在特性有关，但目前针对已知因素的靶向治疗尝试，如多药耐药蛋白（Multidrug Resistance Proteins, MDR1和P-gp）的下调，均未取得显著效果。因此，探索5-FU耐药的分子机制并开发有效的干预措施，对于解决药物耐药问题具有重要意义。

在分子生物学领域，超级增强子（Super-enhancers, SEs）是紧密聚集的增强子簇，它们与转录因子（Transcription Factors, TFs）和共调节因子结合，强烈激活基因转录。SEs的构建和合作调节因子，或称为SE图谱，对精确的转录调控至关重要，它们能够适应不同的空间时间水平，调节特定的基因表达模式，使细胞能够响应不同的微环境，例如药物压力。已有研究表明，SEs可以促进三阴性乳腺癌的化疗耐药性，而与溴域和额外末端域（Bromodomain and Extra-Terminal Domain, BET）抑制剂联合使用时，化疗效果得到增强，主要是由于SEs的破坏和转录调控的紊乱。

在SEs和SE相关基因（SE-related Genes, SRGs）中，一组SE驱动的转录因子可以结合自身的SEs，通过正反馈机制激活自我表达，并形成核心转录调控回路（Core Transcriptional Regulatory Circuitries, CRCs）。CRCs中的TFs调节众多下游靶基因，发挥着维持细胞特性和特定状态的中心调控作用。然而，尽管已有研究描述了胃癌中SE的图谱，大多数研究集中于SE在胃癌发生中的作用，很少有研究探索CRCs和主TFs对化疗敏感性的影响。

本研究中，研究人员对5-FU敏感和耐药的胃癌细胞的SEs和CRCs进行了表征，发现SE驱动的核受体亚家族3组C成员1（Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1, NR3C1）的高表达促进了胃癌细胞的5-FU耐药性。抑制NR3C1的表达可以恢复5-FU的敏感性。NR3C1驱动了SE周围的相分离滴状结构的形成，并参与激活与5-FU耐药性相关的多个靶基因。此外，研究发现表观遗传阅读器抑制剂JQ1和NR3C1特异性抑制剂Cort108297均能通过破坏SEs或直接抑制NR3C1来抑制NR3C1的功能，从而提高胃癌中5-FU的敏感性。这些发现为接受5-FU基础化疗的胃癌患者提供了可能的药物组合方案，具有重要的临床转化价值。

在胃癌治疗中，5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐药性是一个亟待解决的科学问题。研究者们猜想，超级增强子（SEs）和核心转录调控回路（CRCs）可能在调控胃癌细胞对5-FU的敏感性中发挥关键作用。基于此假说，他们采用了染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）技术来绘制与5-FU耐药性相关的SE图谱，并利用小干扰RNA（siRNA）筛选技术来确定由SE激活的主转录因子NR3C1。研究思路是通过分析SEs和SE相关基因（SRGs）在5-FU敏感与耐药胃癌细胞系中的表达差异，来揭示SEs在5-FU耐药性中的作用机制。

研究结果表明，在5-FU耐药的胃癌细胞系HS-746T中，与5-FU敏感的MKN45细胞系相比，存在更多的SEs和SRGs。通过KEGG和GO富集分析，这些SRGs在癌症相关通路中显著富集，包括与5-FU耐药性相关的细胞周期通路。此外，研究人员发现NR3C1的高表达与5-FU耐药性正相关，并且在5-FU耐药细胞中，NR3C1的表达和SEs的特征都有所增加。这些发现强调了NR3C1在5-FU耐药性中的重要作用。

进一步的实验中，研究人员通过荧光恢复后光漂白（FRAP）技术观察到NR3C1蛋白能够形成液-液相分离（LLPS）滴状结构，并且这种相分离的形成依赖于BRD4和MED1。通过CUT&Tag测序技术，他们发现NR3C1与SE区域的结合显著多于典型增强子（TE）区域，表明NR3C1在SE区域的高度富集可能与其在5-FU耐药性中的功能相关。当NR3C1被敲低时，SE的组成和功能显著改变，导致下游基因的转录抑制，从而增加了5-FU的敏感性。此外，使用表观遗传阅读器抑制剂JQ1和NR3C1特异性抑制剂Cort108297，研究者们成功破坏了SEs或直接抑制了NR3C1，进而提高了5-FU在体外和体内模型中的敏感性。

总结而言，该研究揭示了SEs和NR3C1在胃癌5-FU耐药性中的重要作用，并提出了通过破坏SEs或抑制NR3C1来提高5-FU敏感性的潜在治疗策略。这些发现不仅为理解SEs在化疗耐药性中的作用提供了新的视角，也为开发新的治疗手段提供了可能的靶点。

然而，尽管这项研究取得了重要进展，但仍有一些新的问题需要进一步探索，例如SEs和NR3C1在不同胃癌亚型中的特异性作用，以及这些发现在临床上的应用潜力。未来的研究可以围绕这些新延伸问题展开，通过更多的临床样本和前瞻性研究来验证这些发现，并探索SEs和NR3C1在个体化医疗中的应用。

在文中提到的几个关键结果，如“NR3C1的高表达与5-FU耐药性正相关”，“NR3C1能够形成LLPS滴状结构”，以及“JQ1和Cort108297能够通过破坏SEs或直接抑制NR3C1来提高5-FU敏感性”是该研究的核心发现，为未来的研究和临床治疗提供了重要的线索。而这些结果的证据性支撑，如图1展示了5-FU敏感性与SEs的关系，图2揭示了NR3C1与5-FU耐药性之间的相关性，以及图4展示了NR3C1形成的LLPS滴状结构，都为这些结论提供了强有力的实验依据。

在这项研究中，类器官（Organoids）是从胃癌患者的肿瘤组织中培养出来的三维细胞结构，它们保留了原始肿瘤的异质性和微环境特征，因此在疾病模型和药物测试中具有重要应用价值。类器官的培养步骤和应用目的如下：

培养步骤：

1. **组织获取与消化：**首先从胃癌患者手术切除的肿瘤组织中获取样本，并在含有抗生素的培养基中清洗以去除血液和可能的污染物。随后，使用酶消化方法（如胶原酶和中性蛋白酶）将组织块分解成单个细胞或小细胞团。

2. **过滤与铺板：**经过消化的细胞悬液通过70微米细胞筛过滤，以去除未消化的组织碎片。然后，将细胞悬液与基质胶（Matrigel）混合，并铺板于预先处理好的培养皿中。

3. **培养与维护：**将铺好的细胞置于含有生长因子和营养物质的培养基中，培养条件通常为37°C、5% CO2的细胞培养箱。定期更换培养基以维持类器官的生长和健康状态。

4. **类器官扩增与传代：**当类器官生长到一定大小后，可以通过机械切割或酶消化的方式进行传代，以获得更多的类器官用于实验。

应用目的：

1. **疾病模型建立：**类器官作为胃癌患者的体外模型，能够模拟肿瘤的生物学行为，包括生长、侵袭和对药物的响应。

2. **药物敏感性测试：**通过将类器官暴露于不同浓度的5-FU或其他药物中，可以评估患者源性肿瘤对特定药物的敏感性，为个性化医疗提供依据。

3. **药效学研究：**类器官可以用来测试新药或药物组合的效果，包括JQ1和Cort108297等针对SEs和NR3C1的药物，以增强5-FU的疗效。

4. **机制探索：**类器官提供了一个平台，用于研究SEs、NR3C1以及其他分子在肿瘤发展和药物耐药性中的作用机制。

通过上述培养步骤和应用目的，类器官技术在胃癌的研究中发挥着至关重要的作用，不仅有助于理解疾病的复杂性，还为开发新的治疗方法提供了有力的实验工具。

这项研究的特色与创新之处主要包括：

1. 超级增强子（Super-enhancer, SE）与药物抗性关联研究：

• 该研究通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）技术，绘制了与5-氟尿嘧啶（5-FU）抗性相关的胃癌（GC）细胞的SE图谱，这是对SE在药物抗性中作用的深入探索。

• 研究确定了NR3C1（核受体亚家族3组C成员1）作为由SE激活的主转录因子，并揭示了其高表达与5-FU抗性的关联，这是对NR3C1在胃癌中作用的新认识。

• 通过荧光恢复后光漂白（FRAP）技术，观察到NR3C1通过相分离形成液滴，这一发现为理解SE如何通过相分离调控基因表达提供了新的视角。

• 利用CUT&Tag测序技术，研究了NR3C1与SE的共结合模式，为理解NR3C1如何通过SE调控下游基因提供了新的数据。

• 研究提出了通过破坏SE或抑制NR3C1来提高5-FU疗效的新治疗策略，包括使用表观遗传阅读器抑制剂JQ1和NR3C1特异性抑制剂Cort108297，这为临床治疗提供了新的治疗思路。

• 研究不仅在细胞层面进行了机制探索，还在患者衍生的类器官（PDOs）和患者衍生异种移植瘤（PDXs）模型中验证了NR3C1抑制对5-FU敏感性的影响，这增强了研究结果的临床相关性。

这些特色和创新点展示了该研究在胃癌治疗领域的新发现，特别是在SE和NR3C1在药物抗性中的作用机制，以及潜在的新治疗策略的开发。

这项研究虽然在胃癌治疗领域提供了新的见解和潜在的治疗策略，但也存在一些不足之处，主要包括：

1. 分子机制的深入探索有限：

• 尽管研究揭示了NR3C1在5-FU抗性中的作用，但对于NR3C1如何具体调控下游基因表达的详细分子机制，以及与其他转录因子的相互作用网络，仍需进一步深入研究。

• 研究主要基于细胞系和PDX模型，虽然这些模型在一定程度上模拟了人类胃癌的生物学特性，但它们不能完全代表人类肿瘤的复杂性。因此，研究结果需要在更广泛的临床样本中进行验证。

• 虽然研究提出了JQ1和Cort108297与5-FU联合使用可能提高治疗效果，但这些药物组合的长期效果、安全性以及潜在的副作用尚未在临床试验中得到充分评估。

• JQ1作为一种表观遗传阅读器抑制剂，可能具有较宽的靶向谱，这可能导致非特异性的效应和副作用。因此，需要进一步研究其特异性和靶向性，以及如何优化药物设计以减少非靶向效应。

• 研究虽然提出了潜在的药物组合方案，但未涉及个体化治疗策略的开发。考虑到不同患者之间的遗传和表型异质性，未来的研究需要探索如何根据患者的特定生物学特征来定制个性化治疗方案。

这些不足之处提示了未来研究的方向，包括深入探索分子机制、扩大临床样本研究、评估药物组合的长期效果和安全性，以及开发个体化治疗策略。

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