Nature communications:类器官模型助力解析dysadherin/MMP9轴修饰细胞外基质以加速结直肠癌的进展

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。结直肠癌的发展和转移不仅受到肿瘤抑制基因或原癌基因的体细胞突变的影响，还与肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的重构密切相关。肿瘤微环境由细胞组分和非细胞组分构成，包括成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞以及生物活性因子和机械属性等。在肿瘤发展的早期阶段，肿瘤细胞衍生的生长因子和炎症因子招募并激活基质细胞，导致细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）成分的分泌和沉积，进而影响肿瘤的进展。

细胞外基质（ECM）作为TME中的关键非细胞组分，在肿瘤进展中持续经历重塑过程，这一过程特征为ECM成分的沉积、修饰和降解。ECM的重塑不仅增强了肿瘤细胞逃避免疫监视的能力，还触发了整合素介导的机械信号传导，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移特性。在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中，ECM的降解为肿瘤细胞提供了路径，使其获得增殖、侵袭和迁移特性。在预转移位点，肿瘤细胞衍生的因子如生长因子和细胞因子激活癌相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs），重塑ECM，并与其他基质细胞如内皮细胞和免疫细胞相互作用，形成有利于转移肿瘤细胞定植的微环境。

在这一领域，研究进展显示，ECM重塑对肿瘤进展和转移的影响受到了越来越多的关注。然而，尽管已有研究揭示了ECM重塑在肿瘤发展中的作用，但对于特定分子如何调控ECM动态变化以及如何通过ECM重塑影响肿瘤微环境的具体机制仍知之甚少。此外，尽管已有一些针对ECM重塑的靶向治疗策略，但如何有效整合这些策略以提高治疗效果仍是一个挑战。

有趣的科学问题在于，特定的肿瘤相关分子如何通过直接或间接的方式调控ECM的重塑，以及这些变化如何反过来影响肿瘤微环境和肿瘤细胞的行为。例如，膜糖蛋白dysadherin（dysadherin）与肿瘤的侵袭表型显著相关，但其在ECM重塑和TME调节中的具体作用尚不清楚。此外，dysadherin是否能够成为CRC治疗的潜在靶点，以及其如何影响肿瘤微环境中的免疫和血管生成环境，都是值得深入探究的科学问题。这些研究不仅能够增进我们对肿瘤发展机制的理解，还可能为开发新的治疗策略提供重要的分子靶点，具有重要的科学价值和临床意义。

在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的研究领域中，科学家们面临着理解肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑对肿瘤进展影响的挑战。基于此，本研究提出了一个科学问题：dysadherin是否通过直接靶向基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase 9, MMP9）来调控ECM重塑，进而加速结直肠癌的进展？ 针对这一猜想，研究者们设计了一系列实验来验证dysadherin和MMP9之间的相互作用及其在肿瘤微环境中的作用机制。

研究者们采用了基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）和单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据来分析CRC患者样本中的dysadherin和MMP9表达模式。通过这些方法，他们发现肿瘤组织中dysadherin和MMP9的表达水平较正常组织显著上调，并且两者之间存在正相关关系。此外，利用免疫荧光（Immunofluorescence, IF）和原位酶谱分析（In situ zymography）技术，研究者们在CRC患者组织中观察到dysadherin和MMP9的共表达与ECM成分的沉积和蛋白酶活性的增加有关。

进一步的机制探究中，研究者们利用CRISPR/Cas9技术构建了dysadherin基因敲除（Knockout, KO）小鼠模型，并在这些模型中评估了ECM重塑的潜力。结果显示，dysadherin的缺失显著减少了肿瘤的发生，并降低了肿瘤侵袭前沿的胶原蛋白I沉积和ECM蛋白酶活性。这些结果强调了dysadherin在CRC中ECM重塑中的重要作用。

在分子层面，研究者们通过Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 和 GSEA分析了dysadherin KO细胞的RNA测序数据，揭示了dysadherin可能通过FAK/c-JUN轴来调控MMP9的表达。通过免疫印迹（Immunoblotting）和荧光素酶报告基因分析（Luciferase Reporter Assay），他们证实了dysadherin过表达（Overexpression, OE）能够增加MMP9的表达和活性，而dysadherin的缺失则降低了MMP9的表达和活性。

这些发现表明，dysadherin/MMP9轴不仅增强了CRC细胞的侵袭性和ECM蛋白酶活性，还激活了CAFs，通过合成ECM组分来重组ECM，从而促进肿瘤的进展。 尤为重要的是，研究者们在人化小鼠模型中发现，dysadherin的缺失导致了免疫抑制和促血管生成环境的显著降低，而这些效应在MMP9过表达时被逆转，突出了dysadherin/MMP9轴在塑造恶性TME中的复杂和关键作用。

总结而言，本研究不仅揭示了dysadherin通过影响TME中的ECM重塑来促进CRC进展的新机制，而且提出了dysadherin可能是CRC治疗的潜在靶点。这些发现为未来的研究开辟了新的方向，即探索dysadherin/MMP9轴在肿瘤免疫微环境和血管生成中的作用，并为开发针对这一轴的新疗法提供了理论基础。未来的实验可以进一步探索dysadherin/MMP9轴在不同CRC亚型中的作用，并评估靶向dysadherin/MMP9轴对肿瘤生长和转移的影响，以及其在临床治疗中的潜在应用。

在这项研究中，类器官（organoids）的培养步骤和应用目的如下：

类器官培养步骤：

1. 组织获取与处理： 研究者从24周龄的ApcMin/+;Fxyd5+/+和ApcMin/+;Fxyd5-/-小鼠的肠道肿瘤中分离出单细胞。首先，将含有肿瘤的小鼠肠道置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的螯合缓冲液中冰上孵育60分钟，以去除正常的肠道上皮细胞，留下粘附于间质的肿瘤细胞。

2. 细胞分离： 经过EDTA处理后，使用胶原酶进一步将肿瘤细胞从肠道片段中解离。

3. 细胞培养： 将分离的肿瘤细胞计数并离心，然后在96孔板中种植2000个细胞/孔，或与10μL的Matrigel混合后种植，Matrigel是一种基底膜基质，有助于类器官的形成和维持。

4. 培养基添加： 在Matrigel凝固后，向孔中添加200μL的IntestiCult™ Organoid Growth Medium（小鼠专用），为类器官的生长提供营养。

5. 培养与观察： 类器官在37°C的条件下培养，并定期观察其形态和生长情况。

应用目的：类器官在这项研究中的应用目的主要包括：

1. 模拟肿瘤微环境： 类器官提供了一个体外模型，用以模拟肿瘤细胞与其微环境的相互作用，这对于理解肿瘤进展和转移的机制至关重要。

2. 评估ECM重塑： 通过将DQ-collagen I（一种用于检测MMP活性的荧光底物）混合在Matrigel中与类器官共培养，研究者可以评估dysadherin缺失对ECM重塑和蛋白酶活性的影响。

3. 研究肿瘤细胞的侵袭性： 类器官可以用来研究肿瘤细胞的侵袭能力，这对于了解肿瘤如何穿透基底膜并开始转移的过程非常重要。

4. 药物筛选和疗效评估： 类器官可以用于测试不同药物对肿瘤生长和侵袭的影响，为药物开发和个性化医疗提供实验依据。

通过这些培养步骤和应用目的，研究者能够深入理解dysadherin在结直肠癌发展中的作用，并探索可能的治疗干预措施。

这项研究的特色与创新之处主要体现在以下几个方面：

1. dysadherin/MMP9轴的发现： 该研究揭示了dysadherin与MMP9之间的直接联系，并提出了这一轴在结直肠癌进展中的重要作用，这是之前研究中未充分探索的新机制。

2. 多维度分析方法的应用： 结合了基因集富集分析（GSEA）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫荧光（IF）和原位酶谱分析等多种技术手段，为揭示复杂的肿瘤微环境提供了全面的视角。

3. 类器官培养技术的应用： 利用从ApcMin/+小鼠模型中提取的肿瘤细胞培养类器官，模拟了肿瘤微环境，提供了一种新颖的体外模型系统，用于研究肿瘤细胞与微环境的相互作用。

4. 人化小鼠模型的建立： 通过建立人化小鼠模型，研究者能够在接近人类生理条件下评估dysadherin对肿瘤免疫微环境和血管生成的影响，这对于临床治疗策略的开发具有重要意义。

5. 潜在治疗靶点的识别： 研究不仅揭示了dysadherin在肿瘤发展中的作用，还提出了dysadherin可能是结直肠癌治疗的潜在靶点，为未来的药物开发和治疗策略提供了新的方向。

6. 肿瘤微环境的全面解析： 该研究深入探讨了dysadherin如何通过调节ECM重塑来影响肿瘤微环境中的免疫和血管生成成分，为理解肿瘤微环境的复杂性提供了新的见解。

7. 跨学科研究方法的融合： 结合了分子生物学、遗传学、病理学和免疫学等多个学科的研究方法，展现了跨学科合作在解决复杂科学问题中的强大力量。

这些特色和创新点不仅推动了对结直肠癌发展机制的理解，也为未来的临床治疗提供了新的思路和潜在的干预策略。

尽管这项研究在结直肠癌领域提供了新的见解和潜在的治疗靶点，但也存在一些不足之处，具体包括：

1. 样本量的局限性： 研究中使用的样本量可能限制了结果的普适性和统计功效，特别是在进行患者样本分析时。更大的样本量可能有助于进一步验证研究结果的稳健性。

2. 单一癌种的研究范围： 研究主要集中在结直肠癌一种癌症类型上，这可能限制了发现的广泛适用性。不同癌症类型可能有不同的微环境和治疗响应，因此，需要在其他类型的癌症中进一步验证dysadherin/MMP9轴的作用。

3. 缺乏长期的临床跟踪数据： 研究中缺少对患者长期生存和疾病复发的跟踪，这对于评估dysadherin作为潜在治疗靶点的临床相关性至关重要。

4. 机制研究的深度： 尽管研究提出了dysadherin通过FAK/c-JUN轴调控MMP9的假设，但对于这一信号通路的详细分子机制仍有待深入探究，包括其他可能的信号分子和反馈调控机制。

5. 药物干预实验的缺失： 研究中虽然提出了dysadherin可能是潜在的治疗靶点，但缺少直接的药物干预实验来验证这一假设。未来的研究可以探索特定的药物或化合物对dysadherin/MMP9轴的调控效果，以及这些干预措施对肿瘤生长和转移的影响。

这些不足之处提示了未来研究的方向，包括扩大样本量、在多种癌症类型中验证发现、进行长期临床跟踪研究、深入探索分子机制，以及开展药物干预实验。通过这些努力，可以进一步增强研究结果的可靠性和临床应用潜力。

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