Developmental Cell:类器官揭示形态发生和再生过程中共享的保守核心转换细胞状态程序控制肺部上皮细胞命运

在探讨肺脏发育和再生过程中的细胞命运决定机制时，我们不可避免地要涉及到一系列复杂的生物学过程和分子调控网络。肺脏作为呼吸系统的核心器官，其发育始于胚胎期，并伴随着个体的整个生命周期不断进行结构和功能的调整。在这一过程中，细胞状态的转变（Morphogenesis）和组织损伤后的再生（Regeneration）是两个关键的生物学事件，它们共同决定了肺上皮细胞的命运。

细胞状态的转变涉及到从原始干细胞状态到成熟功能细胞的多步过程，这一过程中的细胞命运决定对于肺脏的正常发育至关重要。在肺脏发育的早期阶段，多能干细胞通过一系列复杂的分子信号和转录调控网络，逐步分化为肺泡和气道上皮细胞。这些细胞不仅构成了肺的基本结构，还承担着气体交换和防御外来颗粒入侵的重要功能。然而，对于这些转变状态的细胞如何响应形态发生信号并最终确定其命运的具体机制，科学界的认识仍然有限。

再生过程则是在肺组织受到损伤后启动的修复机制，这一过程中涉及到损伤细胞的清除、新细胞的生成和组织的重建。特别是在严重的肺损伤后，如肺纤维化，肺脏的再生能力显得尤为重要。在这一过程中，一个被称为“过渡态细胞”（Transitional Cell State）的特殊细胞群体引起了研究者的广泛关注。这些细胞表现出多能性，能够在肺脏发育和再生过程中响应不同的微环境信号，进而分化为不同类型的肺上皮细胞。然而，这些过渡态细胞的具体身份、功能以及它们在肺脏发育和再生中的作用尚不完全清楚。

在这一研究领域中，一个重要的科学问题是如何识别和理解这些过渡态细胞的状态，以及它们如何控制肺上皮细胞的命运。以往的研究虽然在肺脏发育和再生的分子机制上取得了一定的进展，但对于这些过渡态细胞的全面理解仍然存在空白。例如，尽管已有研究识别了一些与过渡态细胞相关的分子标记，但对于这些细胞如何在发育和再生过程中响应不同的信号并最终分化为特定细胞类型的动态过程，仍然缺乏深入的认识。

此外，对于人类和模式生物（如小鼠）肺脏发育过程中的保守性和差异性的理解，也是当前研究的一个重要方向。这些知识对于开发新的治疗策略，如促进肺损伤后的再生和修复，具有重要的潜在价值。因此，深入研究这些过渡态细胞的分子机制，不仅能够增进我们对肺脏发育和再生过程的理解，还可能为治疗相关的肺部疾病提供新的策略和靶点。

在生物医学领域，科学家们一直致力于探索肺脏发育和再生过程中的细胞命运决定机制。基于现有的研究进展，提出了一个核心的科学问题：在肺脏发育和再生过程中，是否存在一个保守的过渡态细胞状态，控制着肺上皮细胞的命运？针对这一问题，研究者们提出了一个猜想或假说：ICAM1/NKX2-1 标识的上皮祖细胞在胎儿和再生肺中经历一个高度保守的过渡态细胞状态程序，控制着形态发生和再生过程中的关键结果。

为了验证这一假说，研究者们采用了单细胞基因组学方法，通过对小鼠E14.5胚胎肺的EpCAM+ 上皮细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并结合蛋白质活性推断（PISCES）分析，来识别和表征处于Sox9-Sox2转换期间的细胞。研究思路是通过流式细胞分选（FACS）和三维类器官培养技术，从胚胎肺中分离出高表达和低表达ICAM1的细胞群体，并在不同的培养条件下测试它们的多能性和分化潜能。结果分析显示，ICAM1high 细胞群体在类器官培养中表现出了过渡态细胞的特征，能够响应不同的微环境信号，分化为肺泡和气道细胞类型。此外，通过体内谱系追踪分析，证实了这些过渡态细胞在发育和再生过程中作为多种肺上皮细胞类型的共同祖细胞。

这些发现强调了ICAM1/NKX2-1 过渡态细胞状态在肺脏发育和再生中的重要作用。研究结果表明，这些细胞不仅在小鼠中保守，而且在人类胎儿肺的发育过程中也表现出高度的保守性。在人类胎儿肺的单细胞数据中，同样观察到了与小鼠中相似的ICAM1 表达模式，以及与过渡态相关的基因表达特征。这些结果支持了研究者的猜想，即存在一个保守的过渡态细胞状态程序，控制着肺上皮细胞的命运。

总结与结论部分，研究明确了ICAM1/NKX2-1 过渡态细胞状态在肺脏发育和再生中的核心作用，并揭示了这一状态在人类和模式生物中的保守性。这些发现不仅增进了我们对肺脏发育和再生机制的理解，而且为未来治疗肺疾病提供了潜在的新靶点。

然而，研究也提出了新的延伸问题和下一步实验的方向。例如，这些过渡态细胞在肺损伤后的再生过程中的具体作用机制是什么？它们如何响应不同的损伤信号？这些问题的探索将有助于我们更深入地理解肺脏再生的分子基础，并可能为开发新的治疗策略提供重要的线索。未来的实验可以围绕这些过渡态细胞的详细分子调控网络进行，以及它们在不同肺疾病模型中的功能研究，从而为肺脏疾病的治疗提供更加精准的靶点。

在这项研究中，类器官培养技术被用于模拟和研究肺脏发育和再生过程中的细胞命运决定。类器官是一种体外培养的三维细胞结构，能够模拟其来源组织的组织结构和功能。在本研究中，类器官培养步骤如下：

1. 细胞分离：首先从E14.5的小鼠胚胎肺中分离出上皮细胞。通过流式细胞分选（FACS）技术，根据细胞表面标志物EpCAM和ICAM1的表达水平，分离出高表达和低表达ICAM1的细胞群体。

2. 类器官形成：将分离得到的细胞重悬于Matrigel中，并在含有LPM3D（用于支持远端肺上皮祖细胞扩增的培养基）或MTEC（用于支持气道细胞程序的培养基）的培养孔中培养。这些培养基含有生长因子、激素和其他必需的营养成分，以支持类器官的生长和发育。

3. 培养条件优化：类器官在37°C、5% CO2的条件下培养，并且每两天更换一次培养基，以保持培养环境的稳定性和提供必要的营养。

4. 药物处理：为了研究特定信号通路对细胞命运的影响，类器官在培养过程中可能会被暴露于特定的抑制剂或激活剂，如Nutlin3a（用于激活p53信号通路）或AP-1抑制剂。

5. 分析和鉴定：培养一定时间后，通过免疫荧光染色、RNA原位杂交和定量PCR等技术对类器官进行分析，以鉴定细胞类型、检测基因表达和蛋白水平的变化。

类器官培养的应用目的在于：

• 模拟发育过程：类器官提供了一个体外模型，用以模拟肺脏发育过程中的细胞状态转变和命运决定。

• 研究再生机制：通过模拟肺损伤后的再生过程，研究者可以探索肺上皮细胞的再生能力和机制。

• 鉴定干细胞潜能：通过在不同培养条件下诱导类器官分化，鉴定ICAM1high和ICAM1low细胞群体的多能性和分化潜能。

• 药物筛选和毒性测试：类器官可以用来测试药物对肺上皮细胞的影响，以及评估药物的疗效和毒性。

通过这些培养步骤和应用目的，研究者能够深入理解肺脏发育和再生的复杂过程，并为未来的治疗策略提供实验依据。

这项研究的特色与创新之处主要体现在以下几个方面：

1. 跨物种保守性研究：研究揭示了人类和小鼠肺脏发育过程中高度保守的过渡态细胞状态程序，这不仅增进了对肺脏发育基本机制的理解，也为跨物种研究提供了新的视角。

2. 单细胞基因组学的应用：通过单细胞RNA测序技术，研究者能够精确地识别和表征处于Sox9-Sox2转换期间的细胞，这种方法提供了前所未有的细胞异质性解析能力。

3. 类器官培养技术的创新应用：研究中利用类器官培养技术模拟肺脏发育和再生过程，这种体外模型能够更直观地观察和研究细胞命运决定过程，为研究提供了一个强大的实验平台。

4. 动态蛋白质活性推断（PISCES）：研究中运用了PISCES方法来推断单细胞中的蛋白质活性，这种方法结合了转录组数据和蛋白质-靶标相互作用网络，为理解细胞状态转换提供了新的维度。

5. 体内外实验的结合：研究不仅在体外进行了细胞命运的分析，还通过体内谱系追踪实验验证了体外发现，这种体内外相结合的研究策略增强了研究结果的可靠性和生物学意义。

6. 功能分析与基因表达的整合：通过将功能分析与基因表达数据整合，研究揭示了特定细胞标记物在肺脏发育和再生中的作用，为理解肺上皮细胞命运的分子调控网络提供了新的认识。

7. 细胞状态转换的动态追踪：利用RNA velocity等技术，研究者能够追踪细胞状态的动态变化，这对于理解细胞如何响应发育和再生信号具有重要意义。

这些特色和创新点不仅推动了肺脏发育和再生领域的发展，也为未来的生物医学研究提供了新的方法和思路。

尽管这项研究在肺脏发育和再生领域取得了显著进展，但仍存在一些不足之处，具体包括：

1. 细胞状态的动态变化机制尚不完全清楚：虽然研究识别了ICAM1/NKX2-1 过渡态细胞状态，并揭示了其在肺脏发育和再生中的保守性，但对于这些细胞状态如何响应具体信号并进行动态转换的详细分子机制仍需进一步阐明。

2. 人类数据的局限性：研究中涉及的人类数据主要来源于胎儿肺组织，而对于成人肺组织以及特定肺部疾病状态下的数据较为有限，这限制了研究结果在成人肺疾病治疗中的直接应用。

3. 体外模型与体内环境的差异：尽管类器官培养技术提供了一个强大的体外模型，但这些模型仍然无法完全复制体内复杂的微环境和生理条件，这可能影响对细胞行为的全面理解。

4. 长期功能和安全性评估的缺失：研究主要关注了过渡态细胞状态的短期特性和功能，而对于这些细胞在长期培养中的功能稳定性和安全性评估不足。

5. 治疗应用的转化研究不足：虽然研究为肺脏疾病的治疗提供了潜在的新靶点，但关于这些发现如何转化为临床治疗策略的具体研究还相对欠缺，需要更多的转化研究来探索其在治疗肺疾病中的应用潜力。

这些不足之处提示了未来研究的方向，包括深入探索细胞状态转换的分子机制、扩展人类数据的研究范围、改进体外模型以更好地模拟体内环境、以及加强基础研究成果向临床治疗的转化。

与千万同行共同关注类器官！