Nature protocols:从iPSC建立可长期培养人类的小脑类器官

文摘   2024-12-05 11:49   浙江  

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人类大脑的发育和疾病研究一直是神经科学领域的重要课题。在这一领域中,人类小脑(cerebellum)作为关键的脑区之一,不仅参与运动控制,还与认知功能和情感调节等高级神经活动密切相关。然而,由于人类小脑发育和疾病研究缺乏能够模拟小脑细胞多样性和功能特性的体外模型系统,相关研究进展受到了限制。近年来,随着诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells, hES cells)技术的发展,科学家们开始利用这些干细胞来源的小脑类器官(cerebellar organoids, hCerOs)模型,以期在体外模拟人类小脑的发育过程和疾病状态。

小脑类器官模型的发展,为研究人类小脑的细胞多样性、区域特性以及疾病机制提供了新的工具。这些模型能够模拟胎儿小脑的细胞多样性,并展现出一些独特的细胞结构特征。例如,通过特定的信号通路激活,可以诱导干细胞分化为小脑兴奋性和抑制性前体细胞群体,进而分化为颗粒细胞(granule cells)和浦肯野细胞(Purkinje cells)等小脑主要神经元类型。这些类器官不仅能够用于分子、细胞和功能实验,包括单细胞转录组学(single-cell transcriptomics)、免疫组织化学(immunohistochemistry)以及钙动态和电生理特性的研究,而且通过长期培养,能够实现浦肯野细胞的健康存活和成熟,这些细胞展现出与体内相对应的分子和电生理特征。

尽管小脑类器官模型取得了一定的研究进展,但仍存在一些挑战和不足。例如,类器官内部的营养和氧气输送不足,特别是影响类器官核心区域,限制了其生长;缺乏周围胚胎组织的指导,影响了细胞的组织结构。此外,类器官缺乏与小脑发育后期相关的外来神经类型,如攀爬纤维和苔藓纤维,这些神经类型在小脑功能中起着重要作用。为了更好地模拟小脑的传入电路,需要开发新的共培养方法来引入这些神经类型。此外,与前脑类器官相比,小脑类器官中尚未尝试整合其他存在于人脑中的细胞类型,如少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞,这限制了它们在研究发育和疾病中的潜力。

总的来说,小脑类器官模型为研究人类小脑发育和疾病提供了一个强大的平台,尤其是在探索人类特有的小脑贡献于大脑发育、功能和疾病方面。随着技术的进步和新模型的开发,这些挑战有望得到克服,从而进一步推动人类小脑研究的深入。

这项研究通过以下步骤模拟人类小脑的发育:

  1. 干细胞分化:首先使用人类多能干细胞(包括胚胎干细胞hES和诱导多能干细胞hiPS),这些干细胞具有分化成任何细胞类型的能力。

  2. 模式化诱导:通过特定的化学信号和生长因子,如双SMAD抑制剂(SB431542/Noggin)和WNT激活剂(CHIR-99021),促进干细胞向神经外胚层(neural ectoderm)分化,并进一步向小脑命运(caudalization)发展。

  3. 建立组织者环境:模拟小脑发育中的“组织中心”——中脑/后脑边界的组织者(isthmic organizer),通过添加FGF8b等信号分子,引导干细胞分化为小脑的抑制性和兴奋性前体细胞群体。

  4. 前体细胞扩增:在特定的培养基中,如CerDM1和CerDM2,扩展这些前体细胞群体,促进其成熟和分化。

  5. 神经元成熟:在长期培养过程中,使用CerDM3等培养基,添加如stromal cell-derived factor 1a (SDF1a)等因子,促进神经元的成熟和网络形成。

  6. 功能验证:通过免疫组织化学、单细胞转录组学、钙成像和电生理记录等技术,验证类器官中神经元的分子和电生理特性,确保它们与体内小脑的对应细胞相似。

  7. 长期培养:hCerOs可以在体外培养长达数月,模拟小脑的发育和成熟过程,包括浦肯野细胞的成熟和网络整合。

通过这些步骤,研究者能够在体外复现人类小脑的发育过程,并研究其在疾病状态下的变化,为神经发育研究和疾病建模提供了一个强大的工具。

这项研究通过开发和优化人类小脑类器官(hCerOs)模型,不仅成功模拟了人类小脑的细胞多样性和功能特性,而且通过长期培养实现了浦肯野细胞等关键神经元类型的健康存活和成熟,这对于深入理解小脑在大脑发育、功能和疾病中的作用具有重大意义,同时也为研究人类特有的神经发育疾病提供了一个强大的实验平台,有望推动新疗法的开发和精确医疗的实现。


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