文献解读 | 可扩展肝类器官

文摘 2024-12-30 08:43 浙江

发表时间:

2023 年 7 月 19 日

IF：

26.8

作者单位

韩国生物科学与生物技术研究院（KRIBB）干细胞融合研究中心

论文名称

《Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids》

文章整体思路如下，首先通过重编程获得多能干细胞，其次验证了生成的肝类器官具有自我更新的特点，以及具有相关的表征和功能。最后验证了其可重复性地为毒性预测、再生和炎症反应、肝脏脂肪变性等疾病建模和药物筛选提供了强大的肝脏模型。

图1 文章整体思路

首先，第一步便是获得多能干细胞，两种细胞采用两种不同的方法，人包皮成纤维细胞采用赛默飞的仙台病毒重编程试剂盒进行转导。人肝成纤维细胞采用电穿孔的方式，将OCT4、SOX2、KLF4、LIN28转入细胞中，两种重编程后的细胞都表达干细胞相关的标志物，包括SSEA4、OCT4、TRA1-60、NANOG。畸胎瘤实验也出现了三胚层相应的组织，外胚层像黑色素细胞和神经花环；中胚层有软骨组织和脂肪组织，间充质细胞作者都知道有三系分化能力，向骨，软骨和脂肪分化，间充质干细胞包括骨软骨和脂肪都是中胚层来源的细胞。但是间充质干细胞也有跨胚层分化的能力，能够分化为外胚层来源的神经细胞和内胚层来源的肺细胞等；内胚层像肠上皮和腺上皮细胞也在畸胎瘤中被观察到。除了畸胎瘤实验外，也做了三胚层的培养，发现有表达外胚层相关标志TUJ1 NESTIN；中胚层相关标志物aSMA DESMIN；内胚层标志物FOXA2 SOX17。iPSCs或hESCs以逐步的方式分化为终末内胚层(DE)、肝内胚层(HE)、未成熟肝细胞(IH)和成熟肝细胞(MH）。其中值得注意的一点是作者在向肝内胚层和未成熟肝分化都采用缺氧的培养条件，因为缺氧可以在使肝内胚层相关的标志物SOX9高表达，同样在未成熟肝阶段缺氧使细胞大量扩增后移除缺氧条件又使大量的细胞趋向成熟。

图2 多能干细胞的生成、表征及肝分化的方案

在开始分化约22天后，二维单层MHs上出现三维球形结构，在球状结构表面清晰地识别出与实质肝细胞相似的立方细胞形态。这种3D结构与由单层上皮组成的组织来源的类肝器官相当。

为了同时增强类器官的自我更新潜能和肝脏特征，作者通过使用HM培养基进行培养，其主要包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤抑制素M (OSM)、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)和地塞米松。在Matrigel-embedded HM培养条件下，3D类器官在5天的培养过程中显著增大，可以通过机械或酶裂解传代，即使在冷冻和解冻后也能很好地再生。类器官在悬浮和基质中都能够自我更新，并且在长期培养中膨胀良好。类器官可在5个月内传代24次以上，在体外培养后3个月内稳定保持正常核型，并与原始成纤维细胞的短串联重复增殖能力相匹配。值得注意的是，E-cadherin染色的上皮细胞表现出ki67阳性增殖状态，ALB表达强烈。

图3 从PSC产生可扩展的人肝类器官

接下来，在iPSC、HE和2D分化的成熟肝细胞（2D MH）之间比较建立的3D类器官的特征。当将阶段特异性标志物的基因表达水平与2D MH进行比较时，类器官表现出多能性标志物NANOG的较低表达，维持成体干细胞标志物LGR 5的表达，并且表达相似或更高水平的导管标志物SOX9和CK19以及MH标志物ALB、TTR、CK 18和RBP4。通过免疫荧光在HM培养的类器官中观察到上皮标志物（E-钙粘蛋白和ZO 1）、肝细胞标志物（HNF 4A、ALB、AAT和PEPCK）、胆盐外排转运蛋白（MRP 4）、导管标志物（CK 19和SOX 9）和成体干细胞标志物（LGR 5）的高表达水平。代表性地，在iPS_1衍生的类器官中定量ALB+成熟肝细胞群体，其在FACS分析中占38.63%。

图4 PSC来源的人肝类器官的表征

BMP7是骨形态发生蛋白家族的一员，它通过激活Smads信号通路，拮抗转化生长因子β1的致肝纤维化作用。BMP7能够诱导细胞外基质降解，抑制细胞凋亡，减少促炎症因子的表达，促进肝细胞再生，从而在肝纤维化和肝细胞分化中发挥作用。

发现类器官在限定的培养条件下分化不同。EM促进细胞增殖，DM防止细胞凋亡。同时发现在DM处理之前加入BMP 7和EM是增加AL B和CYP3A4表达的最有效条件。然后，作者基于ALB分泌优化分化的时程，这允许作者最终改进分化条件。在任何条件下，与分化的HepaRG细胞（一种广泛使用的肝脏祖细胞系）的3D培养物相比，类器官分泌更多的ALB。

图5 人肝类器官分化的优化

与HM培养的类器官相比，EM培养的类器官呈现出扩大的球形结构，DM培养的类器官具有更小和堆积的形态。与PHH（人原代肝细胞）和人肝组织相比，分化的类器官（DM）表达足够水平的成熟肝细胞标志物，如ALB、TTR和细胞色素p450- 3A 4（CYP3A4）和导管标志物CK19。E-钙粘蛋白、HNF4A、ZO1(紧密连接蛋白)和PEPCK的高表达水平在EM培养的和DM培养的类器官中均得以维持。成熟肝细胞标志物ALB、AAT和MRP 2（胆汁转运蛋白）的表达在DM中强烈增强，而CK19、LGR5和SOX9的表达在DM中与EM中相比降低。LGR5和SOX9的基因表达水平在DM条件下也显示出比EM更大的降低。定量地，在FACS分析中ALB+成熟肝细胞群体占据EM的53.85%和DM的79.44%。

图6 人类肝脏类器官的分化表征

分化后，类器官显示出更多功能成熟的肝细胞特征。高碘酸-希夫染色在分化的类器官中强烈检测到积累的糖原。以及ICG摄取和释放，其用作人肝移植的功能评估，在孵育15分钟后是功能性的。与在2D MH或HM条件下相比，分化的类器官中ALB的分泌有力地增加，这与PHH的水平一致。AAT的分泌在HM培养的和DM培养的类器官中均显著高于2D MH或PHH。尿素产生在分化的类器官中也增加。在药物代谢和毒性中重要的CYP3A4、1A2、2A6和2E1的必需类器官家族的基因表达通过利福平、对乙酰氨基酚（APAP）和硝苯地平处理强烈诱导。因此，作者使用硝苯地平诱导CYP3A4用于进一步的药物代谢研究。与2D MH和HM培养的类器官中的表达相比，DM培养的类器官中的CYP3A4的表达富集，并且通过硝苯地平诱导而有效增加。在硝苯地平诱导的HM-和DM-培养的类器官中均观察到较高的CYP3A4活性，尽管其未达到PHH活性的水平。通过上清液中剩余硝苯地平的药物清除潜力确定的CYP3A4的功能活性在类器官中与在2D MH中相比降低，表明类器官的解毒功能增加。此外，即使是HM培养的类器官也直接将睾酮羟基化为6 b-羟基睾酮，揭示了HM培养的类器官的CYP3A4介导的功能成熟药物代谢活性。此外，通过CDFDA染色在分化的类器官中很好地识别了具有胆管样结构的极化上皮细胞。总体而言，这些数据表明，在作者的系统中分化的人肝类器官表现出功能成熟的肝细胞样特征。

图7 分化的人肝类器官的成熟特征

接下来，为了进一步验证类器官的成熟潜力，作者分析了它们的分子谱。这个团队之前开发了一种肝脏特异性基因表达面板（LiGEP）算法，这是一种基于RNA测序的验证平台，可定量评估肝细胞模型的分化状态并呈现肝脏相似性程度。尽管2D MH显示肝脏相似性评分为31.18%，但类器官在HM-、EM-和DM-培养条件下的相似性分别高达41.94%，45.16%，60.22%。全基因组转录组分析揭示了4个显著的簇，在类似于肝脏的类器官中富集的簇2基因含有众所周知的肝细胞标志物，如TTR、HNF 1A、HNF 4A和SERPINA 1（AAT 1）。来自聚类2的其他细节表明，用于脂质、胆固醇和酒精代谢过程、有机物质分解代谢过程和细胞分泌的基因组在基因本体图中富集，而胆固醇生物合成和补体和凝血级联是类器官中增加的前2种途径。此外，作者分析了与2D MH相比分化的类器官中富集的途径，并且涉及OXPHOS氧化磷酸化、胆汁酸代谢、脂肪酸代谢作为线粒体OXPHOS活性的替代物的OCR在类器官中与通过细胞数量标准化的2D MH中相比有效地增加，OCR用来研究线粒体氧化磷酸化功能。检测时一般先测定正常状态下的基础呼吸（basal respiration），然后加入寡霉素（oligomycin）抑制ATP合酶，这是OCR显著下降，仅余下质子渗漏（proton leak）造成的耗氧率。降低部分即为氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。加入解偶联剂FCCP后，电子传递失去质子梯度的约束，就会以最大速率进行。所以OCR急剧升高，达到最大耗氧量（maximal respiration）。此值与基础呼吸之差，称为呼吸潜力（spare respiratory capacity）。最后加入电子传递抑制剂，如抗霉素A（antimycin A），完全抑制电子传递，耗氧率降至最低。类器官中的基础和最大呼吸和呼吸能力都显著高于2D MH。这些实时监测的生物能量学曲线显示，与2D MH相比，线粒体和糖酵解依赖性ATP产生速率在类器官中增加。更重要的是，HM-或DM-培养的类器官的OCR类似于成人肝组织衍生的肝类器官的OCR。与HepG 2细胞或2D MH中的胆汁酸产生水平相比，分化的类器官中的胆汁酸产生水平也提高了，表明PSC衍生的类器官的功能能力。因此，作者的系统作为功能成熟的肝脏模型的相关平台，并允许作者测试毒性预测，疾病建模和药物筛选的应用。这些应用是在HM条件下进行的，因为HM培养的类器官在长期培养中具有足够成熟的肝脏功能，并且对于进一步应用来说，这是一种及时且具有成本效益的条件，因为它不需要使用EM和DM的额外成熟过程。

图8 人类肝类器官的转录组谱和功能评估

在转录组谱中，类器官以与肝组织相似的水平有效表达I相药物代谢酶和II相解毒酶。在HM培养的类器官中，奥美拉唑处理充分诱导了CYP1A2的活性，尽管其未达到PHH活性水平。因此，作者比较了2D MH和HM培养的类器官之间CYP3A4和CYP1A2/2E1介导的肝毒性药物（分别为曲格列酮和APAP）的毒性特征。对照化合物在2D MH和类器官中是细胞毒性的（鱼藤酮）或安全的（地塞米松），但在2D和3D模型之间针对曲格列酮和APAP的毒性反应是不同的。基于细胞活力的毒性浓度（TC 50）清楚地显示了与2D MH相比类器官的毒性敏感性更低。

有趣的是，0.8μM和4μ M曲伐他汀处理有效地减少了HM培养的类器官中的细胞数量，而在这些浓度下在2D MH中几乎没有毒性。无毒类似物左氧氟沙星仅在测试的最高浓度（100 μ M）下呈现毒性，其使类器官的细胞活力降低36%。最重要的是，基于OCR的线粒体毒性的实时监测精确地指示了在低剂量处理下，例如0.8 μ M和4 μ M，曲伐他汀对线粒体呼吸有损害，而对于左氧氟沙星，在这些浓度下几乎没有检测到毒性，这些数据表明人肝细胞样肝脏类器官保留了其天然药物代谢活性和对毒性的敏感性，因此可用作评价药物毒性的潜在模型。

图9 使用人类肝脏类器官预测毒理学结果

因为再生能力的变化是肝损伤的主要特征之一。在20 mM APAP(对乙酰氨基酚)处理5天后，类器官呈现严重的形态学损伤，尽管在APAP处理60小时后，当在第4.5天更换培养基时，类器官在第7天恢复良好。在更换培养基后，受损的类器官在类器官大小以及从细胞凋亡恢复良好。检测到APAP处理后ROS产生的增加。在20 mM APAP作用5天或60小时后，在类器官中观察到高迁移率族蛋白1（HMGB 1）的表达和胞质易位减少，以及Ki67、E钙粘蛋白和线粒体标记物Tom20的表达减少，尽管表达水平恢复接近APAP后的对照水平。自噬标志物LC 3B的表达被60小时的APAP处理比5天的处理更强烈地诱导，其呈现与ATP含量和GSH/GSSG比率相似的模式。长期的损伤条件可能会阻止自噬依赖性恢复。一致地，在APAP处理的类器官中强烈诱导促炎介质IL-1b、IL-6和IL-8以及病理介质TNF α和FasL的表达。这些结果表明，作者的人类肝细胞样肝脏类器官可能是一个有用的模型，用于了解肝毒性损伤后的再生和简单的炎症反应。

图10 APAP治疗后人肝类器官的恢复和炎症反应

最后，作者通过用油酸酯和棕榈酸酯（在人类肝脏中发现的最丰富的脂肪酸（FA））过度处理来开发脂肪变性模型，以概括肝脏病理学因为FA代谢的基因组，包括FA摄取（FABP 1、ACSL 5和CD 36）、水解（MGLL）和氧化（ACADVL，HADHB和ETFDH）在类器官的转录组谱中富集，作者在HM条件下进行脂肪变性建模，通过明视野显微镜和尼罗红染色观察到的细胞内脂滴的显著积累。

与单独的BSA对照或FA处理相比，FA+依托莫西处理确实强烈增加了细胞内甘油三酯浓度，并且功能上，通过OCR测定的线粒体呼吸通过FA+依托莫西处理广泛降低。相反，通过用L肉碱处理，通过促进线粒体肉碱穿梭，脂肪变性诱导得到极大改善。FA + L-肉毒碱处理明显改善了类器官的表型，并且与单独的FA处理相比，FA+ L-肉毒碱处理有效地降低了脂质积累。此外，线粒体OCR通过FA+ L肉毒碱处理明显恢复，而FA处理的类器官呈现功能受损的OCR。此外，作者还应用了一种抗糖尿病药物二甲双胍，基于其减少肝脂肪变性的功能。FA+二甲双胍治疗略微恢复了形态和脂质积累，如通过用尼罗红染色评估的，尽管在作者的条件下它对甘油三酯的降低几乎没有影响。最后，作者基于尼罗红染色的高含量分析将类器官应用于抗脂肪变性药物筛选，因为作者的类器官模型对脂肪变性病理条件反应良好，并且尼罗红染色明显指示FA积累。在自噬文库中鉴定了恢复表型和脂质积累的前4种化合物，其可以靶向肝脂肪变性。值得注意的是，化合物的抗脂肪变性作用是通过抑制脂肪生成来实现的例如肝脂肪酸移位酶CD36，从头脂肪生成相关因子SREBP被有效下调。在用化合物处理后，与β-氧化CPT 1相关的基因的表达上调。甘油三酯浓度确实被最高命中化合物降低。总的来说，在作者验证该系统的尝试中，类器官在解毒和病理反应方面保留了成熟的肝脏功能，并且它们的可扩展性赋予了用作毒性预测和药物验证平台的潜力。

图11 用于脂肪变性病理学建模和药物筛选的人肝类器官

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