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动物类器官培养是一项利用动物组织或干细胞在体外形成三维微型器官的技术，能够模拟原生器官的结构和功能。近年来，随着干细胞生物学、3D培养技术和生物材料学的快速发展，动物类器官在基础研究、疾病建模、药物筛选和毒性测试等领域展现出巨大潜力。目前，该技术已成功应用于多种动物模型（如鼠、猪、灵长类等）的肝脏、肠道、脑等类器官的培养，但在复杂器官结构的再现、标准化培养体系以及跨物种的生理差异研究上仍面临挑战，未来发展将进一步推动精准医学和替代动物实验的实现。ORGARID SCIENTIFIC为此专门发布《动物类器官手册》，感谢您的关注与支持，如果觉得能够帮助到您，还希望积极转发。
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技术指南
标准动物肠道类器官培养技术指南
一、实验前准备与要求
环境无菌要求：在类器官培养过程中，所有涉及的耗材，包括但不限于离心管、枪头等，必须使用无菌无酶包装的产品。自行采用高温蒸汽灭菌的移液枪头或其他培养耗材的方式是不可取的，这主要是由于在自行灭菌操作过程中，难以确保完全排除引入二次污染的可能性，从而可能对类器官培养的无菌环境造成破坏，影响培养结果的准确性与可靠性。
仪器设备：CO2培养箱(支持干热灭菌型号)、双人单面超净台、倒置荧光显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪和眼科镊若干。
耗材需要：60mm细胞培养皿、100μm细胞滤筛、15ml离心管、1.5ml EP管（无菌无酶）、24孔细胞培养板、金属冰盒和0.22μm细胞滤器等若干。
液体无菌要求：凡接触类器官培养的液体，除能明确无菌无污染的情况外，均需通过 0.22μm 细胞滤器进行过滤除菌，以防意外污染。
操作人员要求：开展类器官分离培养工作的人员，应具备基本的细胞培养经验，熟知无菌操作规范，并仔细阅读本实验方案。
试验前准备：在冰上解冻ORGARID SCIENTIFIC ®动物肠道类器官培养产品及辅助试剂，按照每 100mL 添加 1mL Organoid Antibiotic Ragent（S86308）的比例，将其添加至类器官培养基中。
注意事项：解冻后，建议将上述试剂分别进行分装保存与取用，避免反复冻融。配制好的培养基可在 2 - 8°C 储存，建议两周内使用，也可在 - 20℃保存，需在一个月内用完。
二、动物肠道组织取材方案
适用范围：本方案适用于多种动物，包括家畜（如猪、牛、羊等）、家禽（如鸡、鸭、鹅等）、宠物（如猫、狗和豚鼠等）以及实验动物（如小鼠、大鼠和兔等）。
取材要求：需根据不同体型动物的实际情况，灵活运用本方案的方法建议，务必确保所取肠道组织的隐窝结构完整且活性良好，并排除任何可能造成干扰的因素。
注意事项：
a)小微动物：如鼠，直接取材约 10cm，纵向剖开，用含有Organoid Antibiotic Ragent（S86308）的冷（1 - 2 - 8°C）的 DPBS（S86309）冲洗干净，直至无任何内容物残留，并用手术镊尽可能去除附着在表面的脂肪组织、血渍及其他干扰物。
b)大型动物：用手术刀切除约 10cm 肠段，纵向剖开，用含有Organoid Antibiotic Ragent（S86308） 的冷（1 - 2 - 8°C）的 DPBS 冲洗干净，直至无任何内容物残留，并用手术镊尽可能去除附着在表面的脂肪组织、血渍及其他干扰物。用一枚干净的载玻片轻轻刮去绒毛部分，再取一枚载玻片用力刮下含有肠道隐窝的粘膜层。
组织收集与保存：用无菌离心管收集上述步骤取得的含有隐窝结构的组织，并立即存放到 2 - 8°C 的Advanced Tissue Protection Solution(S86302)中，直至进行隐窝分离步骤。
注意事项：若所获组织中仍残留血渍，建议采用红细胞裂解液Red Blood Cell Lysis Buffer（S86316）清除红细胞干扰。所有样品需在 6 小时内完成隐窝分离并进行培养处理。
三、动物肠道隐窝分离
初步处理：在超净工作台内，取 5mL 冷的（2 - 8°C）Crypt Protection Solution（S86303）置于 10cm 培养皿中。用无菌手术剪和镊再次尽可能去除包括脂肪组织、平滑肌等在内的任何干扰物，然后将组织充分剪碎成 2 - 5mm 的组织碎片。此步骤限时 3min。
注意事项：隐窝活性保护液Crypt Protection Solution(S86303)是本方案的关键，不推荐您使用其他溶液（如 DPBS 等）替代，导致隐窝活性不足而造成的类器官形成率偏低，后续实验无法开展。
组织碎片处理：将含有组织碎片的 Crypt Protection Solution(S86303) 的悬浮液转移到 15mL 无菌无酶离心管中，静置 30s，去除上清部分，加入新鲜的 5mL （2 - 8°C）Crypt Protection Solution(S86303)，重悬组织碎片。重复此步骤三次，以保护隐窝活性。此步骤限时 7min。
组织解离：将上述组织碎片沉淀放入恢复至室温（20 - 25°C）的组织解离液 Tissue Dissociation solution（S86312）或温和型组织解离液Gentle Tissue Dissociation Solution（S86326）的 15mL 离心管中，置于摇床以 200rpm、37°C 孵育 15min，每隔 5min 观察一次，直至组织碎片充分解离。此步骤最高限时 45min。
注意事项：组织解离需根据实际情况灵活调整解离时间。小微动物的肠道隐窝室温解离时间最长不应超过 30min；大型动物来源的隐窝解离推荐在冰上解离 30min，且 15min 后就应每隔 5min 观察解离情况。应根据实际情况调整解离方法与时间，以实现时间短、活性高的目标。
中止裂解与过滤：解离完成后，以 500RCF、2 - 8°C 离心，去除解离液后（离心速度可根据实际情况调整，目的是使解离后的组织碎片沉淀下来），直接加入 5 - 10ml Crypt Protection Solution(S86303)缓慢重悬沉淀，中止裂解，保护隐窝活性与结构。此步骤最高限时 5min。
多次过滤与收集：将悬浮液通过 100μm 的细胞筛网进行过滤，获得滤分 A；将滤分 A 通过 45μm 的细胞筛网进行过滤，获得滤分 B（约 4ml）。用 5ml 左右的 CPS 对 45μm 细胞筛网反向冲洗，收集高纯度隐窝得到滤分 CryptA。将滤分 B 继续用 0.45μm 滤网过滤，获得滤分 C，然后反向洗脱滤网获得 CryptB（参考下图）。此步骤最高限时 10min。
离心获取高质量隐窝：Crypt A 和 B 以 300g，2 - 8°C 离心 5min，然后弃去上清部分，获得高纯度的隐窝。此步骤限时 5min。
注意事项：采用完全方案时，隐窝保护液Crypt Protection Solution(S86303)是必须的。样本不足时，建议直接过滤收集沉淀即可，避免造成样本浪费。
四、类器官培养
隐窝重悬与基质胶处理：去除上清部分，将隐窝重新悬浮在Biotrigel ®基质胶中。基质胶应放在冰上，以防凝固。此过程需尽快执行，基质胶的使用量取决于隐窝颗粒的大小与数量，按照每 30μL 包涵大约 10,000 个隐窝的比例进行。此步骤最高限时 5min。
注意事项：不要过度稀释基质胶（含胶比例不低于 75%），否则可能无法固定，影响类器官形成效率及后续 3D 培养。不同的基质胶固定温度和方法不一样，请严格遵守相应的产品说明书指导。
接种与固化：推荐用 6 孔板进行早期隐窝分离培养，按照每个培养团体积 80μL，持续接种 3-5 个培养团（参考下图）。接种完成后，将培养板放入 37°C 和 5% CO2 的加湿细胞培养箱中 10 - 15min，让基质胶固化。此步骤最高限时 15min。
类器官观察与培养基更换：正常情况下，培养 24 小时后，可观察到大量球状类器官，此时需及时更换对应的增殖培养基以维持类器官的生长。
类器官重固化培养：在培养第3天，用类器官回收液Advanced Organoid Recovery Solution（S86307）将培养基去除，收集类器官后，不做任何解离，仅更换基质胶，按照50μL每孔接种到24孔板，添加新鲜培养基后，继续维持培养直到第7天。具体步骤可参考下述扩增与传代步骤，不做解离即可。
五、类器官扩增与传代
培养团（domes）破坏与转移：用移液器吸取类器官等渗洗涤液 Organoid Washing Isotonic Solution(S86314）以解离培养团(domes)，并将类器官悬浮液转移到 1.5mLPE离心管中。用移液器吹打类器官悬浮液以彻底混合，通过移液管底部产生压力，有助于去除基质胶。此步骤最高限时 10min。
离心与解离处理：在室温下以 500RCF 离心类器官 3min。使用类器官解离液 Organoid Dissociation Solution（S86310）或机械破碎培养团，吸出上清液并分裂类器官。将类器官重新悬浮在 0.2mL 的类器官解离液中，上下吹打几次，并在 37°C 下孵育，直到类器官解体。每 3min 用移液器吹打≥9 次，以帮助破坏类器官结构。密切观测消化程度，以将类器官解离溶液中的孵育时间降至最低。若为机械性破坏类器官结构，请将沉淀重新悬浮在 1.5mL 的Crypt Protection Solution（S86303）中，小心地将类器官悬浮液吹打 30 次以上。此步骤最高限时 10min。
注意事项：解离最好不要超过10min，因为这可能会导致类器官生长不良甚至培养物丢失。
清洗与接种培养：解离完成后，加入1mL Crypt Protection Solution（S86303）清洗一次，并在室温下以 250RCF 离心 3min。吸出上清液并将类器官沉淀重悬于基质胶中（比例不低于 75%），并按照上述步骤将类器官接种到 24 孔板，然后将板转移到加湿的细胞培养箱中在 37°C 和 5% CO2 下固定 15min。然后加入提前 37°C 预热的 CBM 培养基，放回培养箱继续培养。此步骤最高限时 3min。
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六、类器官冻存
准备工作：将类器官等渗洗涤液Organoid Washing Isotonic Solution（S86314），隐窝活性保护液Crypt Protection Solution（S86303）和类器官冻存液 Organoid Cryopreservation Solution(S86317)置于冰上。将需要进行类器官冻存的培养板取出。
类器官计数与合并：使用倒置显微镜，对每孔的成熟类器官进行计数。为保证每管中至少含有 3000 个类器官，可将几孔的培养物合并冻存。
清洗与转移：吸出培养孔中的剩余培养基液体。加入 1mL 冷的（2 - 8°C）Organoid Washing Isotonic Solution（S86314）。使用 Organoid Washing Isotonic Solution（S86314）预先湿润 1mL 的枪头，上下吹打 10 - 20 次吹散基质胶。将含有 3000 个类器官的混合物转移至 1 个 15mL 的离心管，如需要可合并几个培养孔。
再次清洗与转移：使用预先湿润的 1mL 的枪头，将 1mL 冷的（2 - 8°C）Organoid Washing Isotonic Solution（S86314）加入每孔进行清洗，上下吹打 5 次，转移至第 4 步的离心管中。
离心与重悬：以 400g，2 - 8°C 离心 5min。小心去除上清液，不要接触到沉淀的类器官。使用隐窝活性保护液Crypt Protection Solution（S86303）重悬类器官沉淀。轻柔的敲打离心管，或者使用枪头轻柔的吹打，吹散沉淀。再以 400g，2 - 8°C 离心 5min，小心去除上清液。
冻存液重悬与转移：使用 1mL 冰冷的类器官冻存液Organoid Cryopreservation Solution(S86317)重悬类器官沉淀，每管冻存 300 个类器官。使用同一个枪头，将含有类器官的冻存液转移至预先标记好的冻存管中。将冻存管放入具有 500mL 异丙醇的细胞冻存盒或不含 IPA 的冻存盒。
长期储存：将细胞冻存盒置于 - 80°C 冰箱 24 小时后，将细胞冻存管转移至液氮（-135°C）中进行长期的储存。肠类器官可在 - 135°C 下冻存 6 个月。不建议在 - 80°C 进行长期储存。
注意事项：操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与冻存液的接触时间。
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七、类器官复苏
前期准备：冰上解冻 120μL 基质胶，将预先配置好的完全类器官培养基预热至室温（15 - 25°C）。24 孔板的 4 个培养孔需要 3.1mL 完全培养基。配制完全培养基。将所需的 TC 处理的 24 孔培养板置于 37°C 孵箱预热 30min。
解冻与混匀：拿出冻存的类器官，置于 37°C 水浴中。当冻存液变为液体，解冻即完全，此时应在管底观测到类器官。在 37°C 解冻大概需要 2 - 25min，培养物过热会影响类器官的复苏效率。打开前，使用 70% 酒精或异丙醇擦拭冻存管外部。使用移液器将 1mL 隐窝活性保护液Crypt Protection Solution（S86303）直接加入管中。上下吹打 4 次，将冻存管中的内容物混匀。
清洗与转移：用 1mL 隐窝活性保护液Crypt Protection Solution（S86303）将细胞冻存管清洗两次，然后转移到离心管中。务必清洗到细胞冻存管的整个内表面区域，包括盖子内部。
离心与去除冻存液：以 300g，2 - 8°C 离心 5min，去除冻存液。小心去除上清液。避免产生气泡。如果离心后存在气泡，则在吸出上清液体之前，先小心地吸去气泡。
重悬与接种：使用 200μL 枪头，加入 100μL 室温（15 - 25°C）的完全 CBM 培养基重悬类器官。使用 200μL 枪头加入 100μL 基质胶。上下吹打 5 - 10 次，混匀培养物，以确保整个样品的密度和粘度一致。避免产生气泡。
接种与培养：使用预先湿润的 200μL 枪头，吸取 50μL，并加入到提前预热的 24 孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。于 37°C，5％CO2 下孵育 10min，使基质胶固化。使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入 800μL 预热至室温（15 - 25℃）的完全培养基。不要将培养基从培养团上直接加入。将培养板的盖子盖好，并在 37℃和 5％CO2 下进行培养。每周进行三次完全换液。
传代与后续培养：为了获得最佳结果，解冻后应对冻存的类器官进行两次传代。冷冻后，类器官生长变慢。类器官通常在传代后 5 - 10 天进行传代。通常类器官的生长速度应在一次传代后恢复。
注意事项：不建议将类器官暴露于连续复苏 - 冻存的循环中。复苏后第 2 天，就需要更换培养基继续培养。
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