前言
肝脏是人体最大的药物代谢器官，体外代谢模型多以肝脏为基础。常用的体外模型有肝微粒体、肝S9、肝胞质液、原代肝细胞、肝组织切片、重组人代谢酶等。其中，原代肝细胞因具有较好的体外试验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平，成为了体外药物试验的“金标准”，广泛应用于药物代谢与毒理学研究中。
Primary hepatocytes
什么是原代肝细胞
原代肝细胞是从机体内分离后立即培养或者冻存的肝细胞，具有高度分化的特性，是肝脏研究、药物代谢、药物毒性等研究的“金标准”细胞模型。
我国是一个肝病大国，肝病总人数突破4个亿。肝炎病毒研究、非酒精性脂肪肝、肝纤维化肝硬化、肝衰竭以及肝移植，这些肝脏重大疾病的基础研究与药效评价都需要原代肝细胞这个“金标准”细胞模型。
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肝脏是人体最大的药物代谢器官，在中美两国食品药品监督管理局的药物非临床药代动力学指导原则中，原代肝细胞是药物临床前研究的“刚需”。然而，药物代谢的酶具有巨大的人种差异，比如日本人和高加索人的药物代谢酶差异可达十倍。药物代谢酶的差异最终导致用药剂量和药物药效的不同。比如盐酸普奈洛尔、瑞舒伐他丁、酒石美托洛尔等药物，中国人的推荐用药剂量是美国人的一半。因此，适合中国人的药物，最佳的测试模型是中国人种的原代肝细胞。
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Models and Their Applications
基于肝细胞的研究模型及其应用
肝细胞单纯培养
按照西方思维，将纯度大于95%的肝细胞接种到胶原包被板上（贴壁肝细胞），或者接种到非TC处理的孔板内（悬浮肝细胞），置于37℃/5%CO2培养箱中培养。贴壁肝细胞可在体外培养14天左右，适用于机制研究、药物药效评价、药物毒理评价；而悬浮肝细胞仅可在体外培养2-6小时，肝细胞很快发生失巢凋亡，适用于短时间的实验，如药物代谢、细胞与抗体结合等。贴壁肝细胞在体外很容易发生去分化，丢失肝脏很多生理功能，如乙肝病毒受体NTCP和易感性在铺板后第4-6天发生丢失，因此原代肝细胞铺板后应尽快完成相关实验。
J Virol Methods. 2014 Oct;207:29-37
肝细胞与肝非实质细胞共培养
那为什么原代肝细胞在体外容易去分化呢？肝细胞在体外缺乏了肝细胞与肝非实质细胞的交流，又或者缺乏了肝脏的三维结构。基于以上问题与分析，我司首席科学家周明博士，在硕士期间开展了肝细胞与肝非实质细胞的共培养工作。结果显示，通过共培养，原代肝细胞可在体外长期培养，并在铺板后的72天内仍然保持了乙肝病毒的易感性，说明缺乏细胞间交流是原代肝细胞发生去分化的原因之一。到目前为止，原代肝细胞体外维持四个月的时间记录仍然没有被打破。因此，肝非实质细胞对肝细胞的分化状态的维持是至关重要的。
Virol Methods. 2014 Jan;195:185-93
肝脏圆球体（mini-liver）
肝脏圆球体是将贴壁肝细胞和肝非实质细胞，接种到超低吸附的96U型孔内，在促成球试剂的作用下，肝细胞和肝非实质细胞在24小时内聚集成球，即肝脏圆球体或mini-liver。经过测试，mini-liver可培养长达2个月之久，具有与体内接近的白蛋白分泌、尿素释放、凝血因子F2/F10合成、ASGPR表达。相较于2D培养，乙肝病毒受体NTCP稳定表达。Mini-liver主要优势是三维条件下恢复肝细胞和肝非实质细胞的细胞间交流，实现了肝细胞模型的标准化，可兼容96孔板/384孔板登高通量筛药要求。Mini-liver劣势是组织结构相对混乱，跟体内情况有一定差距。
肝脏芯片
器官芯片是一个多通道的三维微流控细胞培养、集成芯片，模拟整个器官或器官系统的活动、力学和生理反应，是一种人工器官。肝脏芯片实现营养递送与废物排出、模拟肝窦结构与微环境、实现原代肝细胞与肝非实质细胞的细胞间交流，可用于肝脏基础研究和新药评价。肝脏芯片在药物毒性评价方面准确率高达87%，可在体外尽早发现药物潜在毒性，将药物研发的风险前移，从而降低药物研发成本和研发风险。
人鼠嵌合肝
这个模型是将人原代肝细胞注射到重度免疫缺陷、肝脏自损伤的小鼠体内，经过3个月时间，人原代肝细胞在小鼠肝脏中获得生长优势，并逐步替代小鼠肝脏，嵌合率最高可达80%。构建好的人鼠嵌合肝模型，可用于药物代谢、肝炎病原体研究等。同时，人鼠嵌合肝模型可以进一步分离出人原代肝细胞，用于持续扩增人原代肝细胞，扩增次数可达4次。
Liver spheroids VS Liver organoids
肝脏圆球体VS肝脏类器官
目前肝脏类器官在学术界研究火热，很多研究者会问肝脏类器官是否靠谱。小沃结合行业动态，回答如下：
1）肝脏类器官成熟度偏低，大部分研究者养的类器官是胆管类器官；即使是“葡萄状”肝脏类器官，其最高分化状态仅为胎肝阶段，目前工业客户不会使用胎肝用于新药研发；
2）肝脏类器官很难实现标准化，比如细胞个数、类器官大小、类器官成熟度等，很难与标准化、高度分化的肝脏圆球体相媲美；
3）肝脏类器官虽然可以传代培养，但肝脏类器官，使用基质胶和专用培养基等昂贵试剂耗材，培养成本高，实验周期长；
4）肝脏类器官缺乏与肝非实质细胞的交流，在构建模型上有较多局限性。基于上述分析，小编强烈推荐肝脏圆球体，而非肝脏类器官。
Clin Liver Dis (Hoboken). 2020 Feb 25;15(1):3-8
Adherent VS Suspension
贴壁肝细胞VS悬浮肝细胞
同时，小沃经常被问到悬浮肝细胞跟贴壁肝细胞的区别。小沃认为，悬浮肝细胞是受损的肝细胞，丧失了肝细胞的贴壁能力，但因为悬浮肝细胞尚保留了肝细胞的CYP酶，可用于药物代谢等研究。小沃也跟大型CRO公司沟通过，大型CRO公司认同贴壁肝细胞活性更好，在评价药物代谢、药物转运上，与体内情况更接近。那做药物代谢的老师们为什么还利用悬浮肝细胞呢？小沃认为可能是悬浮肝细胞制备简单一些，成本相对较低，久而久之就成为约定俗成的标准。小沃透露一下，立沃生物专注贴壁肝细胞的技术开发，将悬浮肝细胞当做次品而废弃的。
Complete solution
原代肝细胞整套解决方案
在分离培养环节，形成了原代肝细胞分离试剂盒、大鼠/小鼠新鲜贴壁肝细胞、配套试剂耗材、灌注装置等拳头产品，其中，原代肝细胞分离试剂盒可将肝细胞、肝非实质细胞一网打尽，为老师输出完整的成熟体系；活细胞纯化液为立沃生物的专利产品，可为老师们解决原代细胞活力低、细胞碎片多的问题，而且它可帮老师们去掉一部分的细菌污染。如果老师们实验太忙，无法自行分离，我们也可将新鲜分离的肝细胞通过空运发给老师们。
在冻存环节，我们针对放热点的问题，开发了无需液氮的小型程序降温仪，降低客户的使用成本。购买程序降温仪的客户，我司可配套销售我司的原代肝细胞冻存液，确保客户能完全重现肝细胞的高效冻存。
在复苏环节，我司建立了国内最全的原代肝细胞库，包括人、猴、犬、猪、兔、大鼠、小鼠、牛、羊、驴、鸡、鸭、鹅、鱼，满足不同客户的个性化需求。从2023年开始，公司调整战略，提出“出品即精品”，目前客户对我司的肝细胞产品满意度高达90%以上。同时，我司也提供冻存的肝非实质细胞，满足老师们的研究需求。再者，我司提供肝细胞配套培养基和耗材，为技术可行性和售后提供保障。
在CRO服务环节，针对技术尚未成熟的研究者，基于2D原代肝细胞、肝脏圆球体（mini-liver）、肝脏芯片等模型，我们也提供一部分的CRO服务，包括乙肝病毒感染、基因敲出/敲降、基因过表达、药物毒性、药物代谢、药物诱导、小核酸药物药效评价、抗NASH药物筛选、抗纤维化药物筛选等服务。
若您对相关产品感兴趣，欢迎联系立沃生物，我们将持续为您提供更优质的产品与服务！您有任何需求均可致电：
0755-28284050/19902901483(周博）
About Us
立沃生物科技（深圳）有限公司成立于2016年，由深圳市高层次人才团队创立，位于深圳市大鹏新区生命科学产业园A23栋，是国内专业从事原代肝细胞、类器官/器官芯片及人工器官的技术密集型企业。公司技术团队包括美国生物医学与工程院院士、国家“973”首席科学家、深圳市高层次人才、博士、硕士等。
立沃生物先后获得国家高新技术企业（2021年）、生物安全二级实验室（2021年）、ISO9001质量管理体系（2021年-2026年）、GB/T 29490-2013知识产权贯标（2021年-2026年）等资质，授权发明专利3项，实用新型14项，软件著作权3项。原代肝细胞卡脖子突破与转化应用先后获得三项政府资助。拥有研发实验室、原代肝细胞库、GMP生产车间等1500平方米，配套高端检测设备2000余万元。
公司已突破原代细胞标准化、规模化分离与冻存等国外“卡脖子”技术，形成原代肝细胞、肝脏圆球体、肝脏芯片、培养基、耗材、胶原蛋白等一系列科研产品，主要服务于国内顶尖科研机构与生物医药企业。目前，公司正在将前期研究成果的进行医学转化，瞄准肝衰竭晚期疾病，聚焦未来精准医疗新技术，开发同种异体肝细胞、再生肝细胞、人工肝脏等新产品，满足深圳市乃至全国的重大临床需求。
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