引言
HNSCC是全球第六大常见癌症。由于其相对隐蔽的解剖位置，大多数HNSCC病例在晚期才会被诊断出来。尽管HNSCC存在多种治疗手段（手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗），但患者的总生存率在过去十年中并没有显著改善, 因此深入阐明HNSCC的发病机制以及开发新的治疗策略迫在眉睫。
2024年7月9日，安徽医科大学刘业海教授团队、查晓军副教授团队及吴静副主任医师团队携手在Molecular Cancer 在线发表题为“A positive feedback loop between PFKP and c-Myc drives head and neck squamous cell carcinoma progression”的研究论文，该研究证明了PFKP/c-Myc正反馈通路在推动HNSCC进展中的关键作用，并表明同时靶向PFKP和c-Myc可能是一种新型、有效的HNSCC治疗策略。
该研究团队使用伯桢生物头颈鳞癌类器官培养试剂盒(K2109-HN)成功构建了HNSCC类器官，完成了全篇类器官相关实验。
伯桢生物 头颈鳞癌类器官培养试剂盒(K2109-HN）
PFKP在肿瘤组织中高表达，并与HNSCC患者预后不良相关
该研究团队首先利用TCGA-HNSCC数据库分析PFK-1三种亚型(PFKP、PFKM和PFKL)的表达谱及其与患者生存的关系，结果表明只有PFKP在HNSCC组织中表达水平升高。通过免疫组化评估120例HNSCC组织样本及其相应的正常组织中PFKP水平，结果显示肿瘤组织中PFKP表达水平升高。根据HNSCC队列数据发现PFKP表达增加与HNSCC患者预后不良相关。随后，研究团队从患者队列中选择12对样本进行免疫印迹分析，结果证实PFKP在HNSCC样本中的高表达。此外，使用qRT-PCR和免疫印迹检测了三种HNSCC细胞系和NOK细胞系(人正常鳞状上皮细胞系)中PFKP的mRNA及蛋白水平，结果显示与NOK细胞相比，HNSCC细胞系的PFKP显著高表达。
总之，PFKP在HNSCC组织和细胞系中上调，且PFKP高表达预示HNSCC患者预后不良。（图1）
图1.PFKP在HNSCC中表达上调，并与不良预后相关
PFKP增强了HNSCC细胞的体外致瘤能力
该研究团队在类器官水平和细胞水平分别构建了PFKP敲低及过表达两个处理组，结果显示PFKP敲低类器官在PFKP减少后表现出生长速率下降，而过表达PFKP的类器官生长速率则显着升高，且细胞水平结果与类器官结果一致。Ki67染色分析显示，Ki67阳性细胞比例与各类器官中PFKP蛋白表达水平呈正相关。随后通过细胞衍生的CM(条件培养基)培养HUVECs(人脐静脉内皮细胞)，及后续的体外迁移和侵袭实验发现，PFKP敲低组毛细血管样结构和分支点的形成减少，细胞迁移和侵袭受到明显抑制；而过表达组的毛细血管样结构和分支点的形成增加，细胞迁移和侵袭能力增强。同时，研究团队分析了PFKP敲低及过表达细胞中的EMT(上皮-间质转化)标志物(N-cadherin, vimentin和snail)。结果显示PFKP敲低分别降低了N-cadherin、vimentin和snail表达水平，而过表达PFKP则上调了标志物水平。
总之，PFKP可能在体外增强HNSCC细胞的增殖、迁移、侵袭、血管生成能力和糖酵解能力。（图2）
图2. PFKP促进HNSCC细胞的增殖、血管生成、迁移和侵袭
PFKP促进HNSCC在体内的肿瘤进展
为了研究PFKP在体内的功能，研究团队进行了异种移植试验。PFKP敲低组的肿瘤体积和肿瘤重量比对照组小，表明PFKP的敲低明显抑制了肿瘤的生长。免疫组化染色结果显示，PFKP的缺失显著降低了肿瘤组织中Ki-67和CD31的表达，相比之下，PFKP过表达促进了肿瘤生长。通过CAM实验结果显示，抑制细胞中PFKP会导致血管生成反应降低，与之相反的是，细胞中PFKP的过表达促进了移植物血管的形成。通过尾静脉注射肺转移模型研究了PFKP对转移的影响，观察到PFKP敲低组的转移性结节数量显著减少，且肺湿重低于对照组。然而，PFKP过表达组的肺转移增加，肺湿重更重。
总之,这些发现表明PFKP可能促进HNSCC肿瘤的生长、血管生成和体内转移。（图3)
图3.PFKP在体内的促瘤作用
PFKP与ERK2相互作用，激活MAPK/ERK通路
研究团队使用PFKP敲低的细胞和对照组进行了转录组分析，研究结果揭示MAPK途径是PFKP抑制后显著改变的途径之一，ERK途径是所有MAPK信号转导途径中最重要的信号级联，超过90%的HNSCC患者存在磷酸化的ERK1/2。结果表明，细胞中PFKP的敲低导致p-ERK1/2水平降低，而PFKP的过表达导致p-ERK1/2水平升高。通过免疫共沉淀检测证明PFKP可能在HNSCC的进展过程中与ERK2相互作用。在接下来的实验中，进一步确定了PFKP和ERK2之间的结合区域位于氨基酸412-784。通过分子对接模型预测了PFKP与ERK2结合的特定残基为K753。
总之，PFKP可能直接与ERK2相互作用，从而激活MAPK/ERK通路。（图4）
图4 PFKP通过ERK2激活MAPK/ERK通路
PFKP通过激活ERK通路来增强c-Myc蛋白的稳定性
TCGA的GSEA(基因富集分析)数据显示，HNSCC中PFKP高表达组Myc信号所靶向的基因存在富集。与p-ERK1/2水平一致，观察到PFKP敲低的细胞中c-Myc和p-S62-Myc水平显著降低，细胞过表达PFKP导致c-Myc和p-S62-Myc的上调。免疫荧光实验证实了PFKP对c-Myc的正调控作用。然而qRT-PCR结果显示，PFKP对c-Myc的调控不在mRNA转录水平。研究团队通过CHX(环己酰亚胺)追踪分析检测蛋白质稳定性，与对照组相比，PFKP敲低的细胞中c-Myc的降解显著加速。此外，MG132(一种特异性的26 S蛋白酶体抑制剂)预处理可以抑制PFKP耗竭引起的c-Myc的加速降解。随后的泛素化分析表明，PFKP的缺失促进了c-Myc的泛素化和降解，而过表达PFKP则抑制了这一过程。
总之，这些发现支持了上述PFKP可能与ERK2相互作用的结论，且两者通过抑制泛素介导的c-Myc降解过程，上调c-Myc的表达水平。（图5）
图5 PFKP促进了ERK介导的c-Myc的稳定性
c-Myc有助于PFKP介导的HNSCC进展
该研究团队在PFKP敲低的细胞中过表达c-Myc，结果显示，过表达c-Myc逆转了PFKP敲低对于细胞增殖、血管生成、迁移和侵袭的抑制作用。与此同时，将表达靶向c-Myc的shRNA的慢病毒载体转导到过表达PFKP的细胞中，PFKP过表达引起的细胞加速增殖、迁移、侵袭和血管生成功能被c-Myc缺失所抑制。接下来研究团队通过体内皮下异种移植瘤模型、CAM(鸡胚绒毛尿囊膜)实验和小鼠尾静脉肺癌转移模型，进一步分析PFKP介导的c-Myc表达在HNSCC进展、生长、血管生成和转移中的作用。与体外结果一致，c-Myc再表达消除了PFKP减少对异种移植物生长和肿瘤血管生成的抑制作用。这些挽救作用在荷瘤动物的宏观观察、肺组织H&E染色和肺重量测量中都很明显。
总之，PFKP可能通过增强c-Myc表达促进HNSCC进展、生长和转移。（图6）
图6 c-Myc介导的PFKP功能促进HNSCC细胞的增殖、血管生成和转移
c-Myc促进HNSCC中PFKP的转录
研究团队通过生物信息学、TCGA-HNSCC数据及K-M生存分析揭示，转录因子c-Myc与PFKP呈正相关。来自公共数据库的ChIP-seq和RNA-seq数据显示，c-Myc在PFKP的启动子区域具有显著信号，并且淋巴瘤细胞中c-Myc减少后PFKP mRNA水平表达量显著降低。随后，研究团队使用JASPAR(转录因子预测数据库)分析了人类PFKP的启动子区域，预测了两个可能的c-Myc结合位点。然后将人类PFKP基因启动子克隆到pGL3荧光素酶报告基因中，并评估c-Myc对启动子活性的影响。对照组PFKP的启动子活性通过c-Myc过表达而增强，位点1的突变消除了c-Myc的刺激作用，而位点2的突变仅产生轻微影响。综上所述，c-Myc可能通过直接结合其启动子来上调PFKP的转录。免疫组化染色结果显示，与PFKP一致，c-Myc在癌组织中的表达高于其配对的正常组织，并且PFKP和c-Myc高表达的HNSCC患者的总生存期明显更差。
总之，c-Myc可能通过结合PFKP基因的启动子上调PFKP的转录，PFKP和c-Myc都可能与HNSCC的预后有关。（图7）
图7 c-Myc刺激PFKP基因的转录
靶向PFKP和c-Myc可抑制HNSCC肿瘤进展
基于PFKP和c-Myc之间的正反馈通路促进了HNSCC的肿瘤进展，并且PFKP和c-Myc高表达的患者总生存期更差，于是研究团队使用抑制剂10058 - F4共同抑制PFKP和c-Myc，观察是否可以协同阻止HNSCC的进展。首先使用HNSCC类器官模型对PFKP联合c-Myc抑制的效果进行评估，结果显示，PFKP和c-Myc的共同抑制比单独的任何一种抑制处理更有效地抑制了HNSCC类器官的生长。此外，研究团队将LIU-LSC-1细胞注射到裸鼠体内，建立皮下肿瘤模型，用PFKP siRNA或siNC处理小鼠，同时腹腔注射10058-F4或对照。结果表明，PFKP siRNA与10058 - F4联合使用对LIU-LSC-1异种移植物的抑制作用最强，且未观察到治疗小鼠的体重减轻。最后，研究团队选择PFKP和c-Myc高表达的新鲜HNSCC肿瘤建立PDX模型，与CDX研究结果一致，PFKP siRNA和10058 - F4联合治疗比单独治疗更有效地抑制了PDX肿瘤的生长。
总之，共同抑制PFKP与c-Myc可能是一种治疗HNSCC更有效的策略。（图8）
图8 PFKP抑制和10058-F4共同处理对PDO和PDX模型的生长均有抑制作用
总结
该研究揭示了PFKP和c-Myc形成正反馈回路促进HNSCC恶性进展的新机制，并表明同时抑制PFKP和c-Myc可能是未来治疗HNSCC的一种新策略。该研究团队使用伯桢生物头颈鳞癌类器官培养试剂盒(K2109-HN)成功构建了HNSCC类器官，完成了全篇类器官相关实验。通过HNSCC类器官，该研究团队验证了PFKP对HNSCC生长的影响，且证实了PFKP联合c-Myc的共同抑制有效阻碍了HNSCC的生长。
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