摘要：全球范围内，季节性流感病毒的感染每年导致300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。自20世纪30年代发现流感病毒可以在受精卵中培养以来，已经开发了各种流感疫苗，包括灭活裂解型和亚单位型、重组和减毒活疫苗。然而，这些疫苗提供的保护率相当低，特别是在非常年幼的儿童和老年人中。在这篇综述中，我们描述了流感疫苗开发的历史、疫苗诱导的免疫反应以及应用的佐剂。此外，我们提出了提高所有年龄组流感疫苗有效性的未来发展方向。这包括开发一种基于对免疫系统的理解，诱导平衡的辅助性T细胞1型和2型免疫反应的流感疫苗，以及开发一种广谱流感疫苗，即使在流感病毒特有的抗原漂移和变化的情况下也能提高效果。如果能够实现安全有效的佐剂的开发，可以预见一个更光明的未来。
1.引言
流感病毒属于正黏液病毒科，其基因组由负义RNA片段组成。它们被分为A、B、C和D型，后者于2011年4月从表现出流感样症状的猪中分离出来。在人类中，主要是A型和B型引起疾病，A型比B型引起的疾病更为严重。流感A病毒根据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性进一步分类，共有18种HA和11种NA血清型。自20世纪70年代以来，流感B病毒仅分化为两个抗原上可区分的谱系，即山形和维多利亚谱系。目前流行的人类流感病毒主要是A/H1N1和A/H3N2以及B/山形和B/维多利亚谱系。每年，季节性流感在全球造成300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。死亡率和严重病例在65岁以上的老年人和5岁以下的儿童以及免疫抑制人群中更高。用于治疗流感的抗病毒药物包括奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和巴洛沙韦。然而，疫苗接种被认为是控制流感最有效的方法。通过持续的抗原漂移，即表面抗原的点突变积累，流感病毒可以逃避免疫，这就是为什么每年都需要接种疫苗的原因。自20世纪40年代以来，季节性流感疫苗一直在稳步发展，目前市场上的预防性疫苗在类型（全病毒、裂解、重组和亚单位灭活，以及减毒活疫苗）和生产所用的基质（受精卵或细胞）上有所不同。
美国疾病控制和预防中心的一项疫苗有效性研究表明，尽管与流行株抗原匹配，但它们的保护率仍然很低（40%-60%）。令人关注的是，疫苗在非常年幼的儿童（6-35个月）和老年人（>65岁）中不有效地引发免疫反应，这两个年龄组更容易感染流感病毒，并且死亡率更高。因此，迫切需要为所有年龄段提供有效的流感疫苗。
2.流感疫苗的开发历史和疫苗诱导的免疫反应
2.1.流感疫苗开发的历史
流感病毒的培养方法在20世纪30年代得到发展。1933年，通过将从患者喉洗液中获得的标本通过鼻内滴入的方式，将人类流感病毒传播给雪貂。1935年，威尔逊·史密斯提出了一种在受精卵的卵黄囊膜中培养流感病毒的方法。这种方法产生的病毒浓度比以前基于从感染动物的肺部提取病毒的方法要高得多。受精卵至今仍用于生产流感疫苗。此外，自20世纪30年代中期以来，已经开发了使用细胞和培养基的培养方法。随着能够分离和培养流感病毒，流感疫苗的研究开始了。从20世纪30年代中期到40年代初，通过监测抗体产生，研究了从受精卵的羊水或感染动物器官提取物中获得的活化和甲醛灭活的流感病毒在动物和人类中的疫苗效果。发现疫苗与流行株之间的抗原匹配对于保证疫苗效力很重要，而且无论是灭活还是未灭活的病毒，浓缩疫苗比未浓缩疫苗更有效。1942年，在临床研究中评估了由受精卵生产的由PR8型流感A型和Lee型流感B型组成的灭活全病毒双价流感疫苗诱导的免疫反应。1943年，美国武装部队流感委员会进行的更大规模的临床研究表明，包括A型亚型PR8和Weiss株以及B型Lee株的灭活全病毒三价疫苗对流感有保护作用。通过临床试验确定了疫苗剂量，1945年，第一种灭活流感疫苗（IIV）在美国获得许可。
自20世纪40年代在受精鸡卵中开发第一种灭活全病毒疫苗以来，IIV的生产方法不断改进，20世纪50年代，使用受精卵的当前IIV生产过程得以发展。IIV包括全病毒疫苗、通过洗涤剂裂解的病毒和进一步纯化的亚单位疫苗，由表面抗原HA和NA组成。全病毒疫苗，第一种开发的IIV，即使在未预先免疫的个体中也能诱导良好的免疫反应。然而，人们对热原性和不良反应感到担忧。为了克服这些问题，20世纪60年代，通过用乙醚或洗涤剂处理病毒，开发了裂解病毒疫苗，使它们对儿童安全。20世纪70年代，主要基于HA和NA的纯化亚单位流感疫苗得到了发展，进一步提高了安全性并减少了反应原性。
自20世纪30年代以来，通过在雪貂和小鼠或受精卵中连续传代制备的减毒活流感疫苗（LAIV）也得到了研究。这些宿主范围变异疫苗可以保护人类免受流感侵害，而不会引起流感症状。然而，它们有一些缺点，包括低病毒滴度和在保持恒定的减毒和抗原性水平方面的困难。20世纪60年代，采用了一种新的方法，通过在受精卵中连续低温传代来减毒流感病毒，产生了冷适应的、温度敏感的变异株。由于冷适应的温度敏感流感病毒在较低温度下复制得最好，病毒复制在鼻腔而不是在呼吸道进行。这些病毒比以前的减毒方法更安全，并能诱导免疫反应。因此，它们作为LAIV的供体病毒得到了进一步发展。
作为RNA病毒，流感病毒缺乏校对活性，因此遗传上不稳定；因此，抗原突变发生的频率很高。为了提高流感疫苗的保护率，准确预测将流行的流感病毒并生产含有这些毒株的疫苗是很重要的。为此，世界卫生组织（WHO）的全球流感监测和应对系统自1952年以来一直在进行全球流感监测，基于监测结果，WHO每年都会宣布北半球（2月）和南半球（9月）的推荐流感病毒疫苗成分。
最初，世界卫生组织推荐了三种流感病毒株，包括A/H1N1、A/H3N2以及B/维多利亚或B/山形谱系中的任一种，用于三价疫苗；然而，由于两个B谱系的共同循环频率很高，现在建议在四价流感疫苗中同时包含B/维多利亚和B/山形谱系。然而，由于灭活疫苗和减毒活疫苗是使用推荐的候选病毒生产的，如果预测不准确，它们将因抗原不匹配而无效。因此，正在积极研究广谱或通用流感疫苗。这些疫苗类型针对流感病毒的保守区域，如HA的茎部、M2e、M1或核蛋白，而不是免疫显性的、可变的和特定于毒株的HA球形头部（图1）。这些疫苗是通过使用病毒载体、DNA载体、类病毒颗粒（VLP）、纳米颗粒或直接刺激T细胞的肽制备的。其中，纳米颗粒和VLP平台在完成2020年的III期临床试验（NCT04120194、NCT03301051和NCT03739112）时显示出最明显的效果。纳米颗粒（Novavax）和VLP流感疫苗（Medicago）均显示出诱导交叉反应抗体和T细胞反应的结果。
2.2.流感疫苗生产的基质
尽管使用受精卵的传统方法仍然在全球范围内主要使用，但它有显著的缺点。基于鸡蛋的疫苗可能会引起对白蛋白的过敏反应，当对受精卵的需求突然增加时，例如在大流行期间，供应可能不足，妨碍及时生产疫苗。最重要的是，特别是在H3N2的情况下，连续在受精卵中传代病毒可能导致抗原位点的鸡蛋适应性突变，从而导致抗原性改变，从而降低疫苗的有效性。为了克服这些缺点，开发了基于细胞培养的疫苗生产技术。使用的细胞系包括Solvay和Seqirus（前身为Novartis）的Madin-Darby犬肾（MDCK）、Sanofi Pasteur（前身为Crucell）的PER.C6、Baxter的Vero以及Protein Science（重组HA）和Novavax（VLP疫苗）的Sf9昆虫细胞与杆状病毒载体相结合。因此，流感疫苗的开发正逐渐从传统的基于鸡蛋的平台转向细胞培养（图2），尽管需要努力提高后者的产量并降低生产成本。
2.3.FDA批准的流感疫苗及其触发的免疫反应
疫苗触发的免疫反应根据接种物是灭活抗原还是活病毒而有所不同。在灭活病毒疫苗的情况下，通过吞噬作用被抗原呈递细胞（APCs），如树突细胞，吞噬的灭活细胞外抗原。然后在APCs的溶酶体中将抗原降解为肽段，肽段通过主要组织相容性复合体（MHC）II分子呈现在APCs表面。MHC II-抗原复合物被T辅助（Th）细胞识别，也称为CD4+ T细胞，这导致未激活的Th细胞激活。激活的Th细胞进一步分化为T辅助1（Th1）细胞、Th2细胞、Th17细胞、滤泡Th（Tfh）细胞、诱导性调节性T细胞（iTregs）等。
在各种CD4+效应T细胞亚群中，Th1、Th2和Th17细胞在防御病原体方面发挥主要作用。Th1细胞诱导细胞介导的免疫反应，分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），激活巨噬细胞和中性粒细胞，通过增加吞噬作用和炎症来消除细胞内病原体。Th2细胞诱导体液免疫反应，主要分泌IL-4、IL-5和IL-13。最后，Th17细胞分泌IL-17和IL-22，这是促炎细胞因子，以及IL-21，从而刺激对细胞外病原体和真菌的免疫反应。
相比之下，活病毒或减毒活病毒疫苗感染细胞并在感染细胞的细胞质中产生病毒蛋白。病毒蛋白被蛋白酶体降解为肽段，肽段与MHC I分子复合物呈现在感染细胞表面。MHC I-抗原复合物被CD8+ T细胞识别，随后在其他信号和Th细胞帮助下分化为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。树突细胞不易被病毒感染，但通过交叉呈递在激活CD8+ T细胞中发挥重要作用。在这一途径中，被病毒感染的细胞被树突细胞吞噬，导致病毒抗原在树突细胞的细胞质中释放。从蛋白酶体降解到呈递的后续过程与上述MHC I途径相同。当CTLs识别感染细胞上的MHC I-抗原复合物时，它们释放细胞毒素蛋白、穿孔素和颗粒酶，这些蛋白进入感染细胞并诱导凋亡。CTLs还可以通过CTLs上表达的Fas配体与目标细胞上表达的Fas的相互作用来杀死感染细胞。FDA批准了各种类型的流感疫苗（表1），它们引起不同的免疫反应。根据免疫反应诱导机制，流感疫苗大致分为IIVs和LAIVs，IIVs进一步分为全病毒、裂解和亚单位类型。
由于IIVs的活性物质是三个（三价IIVs）或四个（四价IIVs）灭活抗原，接种的抗原主要通过MHC II途径呈现在APCs表面，因此将主要刺激CD4+ T细胞；然而，IIV接种后的免疫反应尚未完全了解。如上所述，CD4+ T细胞可以分化为几种亚型，但IIV主要刺激Th2免疫反应，诱导体液免疫反应而不是细胞免疫反应。IIV诱导的血凝抑制滴度与流感特异性抗体相关，在成人中提供50%的流感感染保护率。然而，IIV不有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫，这在呼吸道病毒感染中起着重要作用。与IIV不同，LAIVs通过鼻内途径给药。它们感染上呼吸道的细胞，并通过MHC I途径更有效地处理，从而诱导粘膜免疫和细胞免疫。此外，LAIVs在CD4+ T细胞的情况下很好地激活Th1免疫反应。尽管LAIV可以被认为是流感的理想疫苗类型，因为它诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，但它存在安全问题，不能在非常年幼的儿童和免疫受损的个体中给药。此外，由于禽流感病毒在人类上呼吸道的嗜性大于下呼吸道，因此不易开发针对禽流感病毒的LAIVs。
3.流感疫苗佐剂开发的现状
3.1.流感疫苗佐剂的必要性
佐剂是增强疫苗免疫反应的制剂，通过每剂使用较低量的抗原，诱导更高的抗体产生和更持久的保护，从而减少疫苗生产的负担。
与季节性流感病毒不同，引起大流行的流感病毒是新的重配或变体病毒，人类对其没有预先存在的抗体，因此导致更高的死亡率。非佐剂化的H5N1和H7N9大流行流感疫苗诱导的免疫反应较弱，可能是因为大多数人对这些亚型没有预先存在的免疫力，并且大流行疫苗不是每年接种。因此，大流行流感疫苗通常使用佐剂，特别是因为它们可以改善因慢性病、肥胖、HIV感染或移植治疗而免疫功能低下的个体的免疫反应。此外，与未添加佐剂的IIV不同，添加佐剂的IIV可以提供平衡的Th1/Th2免疫反应和粘膜免疫，从而保护免受流感感染。
3.2.批准的流感疫苗佐剂的免疫机制
目前流感疫苗中使用的佐剂包括磷酸铝（AlPO4）凝胶、氢氧化铝（Al[OH]3）、AS03和MF59。最古老和最常用的佐剂是AlPO4和Al(OH)3，通常称为铝佐剂（尽管严格来说，铝佐剂指的是硫酸钾铝钾[KAl[SO4]2]）。含有MF59或AS03的流感疫苗是比铝佐剂更晚开发的油包水乳液佐剂，分别在1997年和2009年获得批准。这些佐剂比铝佐剂在IIVs中更有效。美国FDA批准的三种H5N1大流行流感疫苗中有三种含有AS03或MF59佐剂。第三种疫苗不含佐剂，但含有比含佐剂疫苗多12-24倍的HA（表2）。FDA批准的含MF59的佐剂化季节性流感亚单位疫苗（Seqirus，FluAd®）旨在用于老年人（>65岁），他们的免疫反应比年轻成人差（表2）。
尽管铝佐剂长期以来一直被广泛用作佐剂，但其机制仍然未知。最初，人们认为铝佐剂通过所谓的抗原储存效应，通过缓慢且持续地将抗原暴露给APCs来增强免疫反应。然而，最近的研究表明，铝佐剂还可以招募包括中性粒细胞和单核细胞在内的各种类型的先天免疫细胞到注射部位，从而激活先天免疫反应。有关细胞和分子机制的研究报告称，铝佐剂通过APCs吞噬铝佐剂导致的吞噬体不稳定化，触发NLRP3炎症体的激活，从而分泌促炎细胞因子IL-1β。此外，铝佐剂在注射部位引起坏死，导致损伤相关分子模式的释放，如尿酸和DNA，这些分子激活NLRP3炎症体。铝佐剂可以通过前列腺素E2的产生增强免疫反应，前列腺素E2参与诱导Th2免疫反应，通过ITAM-Syk-PI3Kδ信号传导。这些结果表明，铝佐剂诱导Th2反应而不是Th1反应。
MF59是一种由角鲨烯和两种表面活性剂聚山梨醇酯80（Tween 80）和山梨醇三油酸酯（Span 85）组成的油包水佐剂。自1997年首次在欧洲流感疫苗中应用以来，进行了大量的研究以阐明其免疫增强机制。MF59没有储存效应，这一发现表明，即使在抗原注射前24小时至注射后1小时内注射，它也显示出佐剂效应。相反，MF59在注射部位激活单核细胞、巨噬细胞和粒细胞，导致趋化因子的分泌，随后是免疫细胞的招募，增加抗原摄取，单核细胞分化为未成熟树突细胞，以及增强抗原运输到引流淋巴结。MF59诱导的单核细胞分化为未成熟树突细胞有助于它们迁移到引流淋巴结，在那里它们刺激T细胞和B细胞，从而增强适应性免疫反应，对接种的疫苗抗原产生平衡的Th1/Th2反应。此外，MF59佐剂化的抗原在免疫小鼠的淋巴结的各种细胞上呈现，包括B细胞、单核细胞和中性粒细胞，而铝佐剂化的抗原只在树突细胞上呈现，表明MF59在增强免疫反应方面比铝佐剂更有效。MF59导致注射部位的肌肉细胞释放ATP，并通过MyD88发挥其佐剂功能。在动物模型中，局部施用apyrase水解ATP导致对MF59佐剂化的三价IIV的T细胞反应和血凝抑制滴度降低。因此，ATP在MF59佐剂功能中起着重要作用；然而，确切的信号传导途径需要进一步研究。
AS03是一种由聚山梨醇酯80（Tween 80）和两种可生物降解的油，角鲨烯和α-生育酚组成的油包水佐剂，α-生育酚是维生素E的最可利用形式。饮食中的维生素E补充具有免疫刺激作用。因此，α-生育酚表现出类似佐剂的功能，而MF59组分本身并不具有佐剂效应。在小鼠中进行的研究表明，当抗原与缺乏α-生育酚的AS03一起施用时，免疫反应减弱。与MF59不同，AS03需要与抗原在空间和时间上共定位才能作为佐剂发挥作用。与MF59类似，AS03促进免疫细胞招募到注射部位，以及抗原摄取和运输到引流淋巴结。具体来说，AS03在局部和短暂地增加NF-κB，并增强细胞因子释放和免疫细胞招募。随后，激活的抗原负载的APCs在引流淋巴结中激活CD4+ T细胞，这些细胞直接刺激抗原特异性B细胞。因此，AS03通过诱导大量记忆B细胞和抗体分泌浆细胞来加强免疫反应。
3.3.流感疫苗佐剂的开发现状
佐剂在全球范围内被广泛研究。下面，我们讨论了除铝佐剂、MF59和AS03之外，已经进入临床试验的流感疫苗佐剂的机制和免疫反应，包括TLR配体、细胞因子以及微乳液和纳米乳液。此外，还有一些免疫刺激剂，其作用机制尚不完全清楚。在这些研究中，TLR激动剂和配方是最被研究的（表3）。
TLR通过识别病原体相关分子模式来刺激先天免疫反应。根据其定位，它们被分类为细胞表面TLR和细胞内TLR。细胞表面TLR，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别来自微生物膜的成分。细胞内的TLR，定位在内体中，包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，识别自身和非自身核酸。鉴于各种TLR可以识别独特的配体，几种TLR激动剂作为佐剂正在进行临床试验。TLR4激动剂AS01和AS04已获得许可，而其他TLR4激动剂，包括葡萄糖基脂质佐剂、单磷酸脂质（MPLA）和LPS，正在积极研究中。此外，dsRNA、flagellin、imiquimod和CpG分别作为TLR3、TRL5、TLR7和TLR9激动剂正在开发中。
MF59和AS03等乳液颗粒有时与其他物质如皂苷、DNA和MPLA结合。具有不同成分和比例的各种乳液型佐剂正在进行临床试验。其他颗粒类型，如病毒体或VLP，也可能具有佐剂功能。一些作用机制尚不清楚的免疫刺激剂也在研究中。细胞因子在小鼠中刺激Th1免疫反应和B淋巴细胞分化，但在I期临床试验中未显示出佐剂效应。因此，开发一个能够准确预测佐剂效应的非临床系统非常重要。在最近的一项研究中，一种与单链RNA佐剂配制的IIV诱导了对异源流感病毒感染和粘膜免疫反应的交叉保护。其详细机制和安全性方面还有待研究。
4.流感疫苗开发的发展方向
4.1.流感疫苗的现状和相关不良事件
目前市场上的流感疫苗可以用于非常年幼的儿童（≥6个月大），尽管每种产品的推荐接种年龄不同，而且它们大多数是灭活疫苗。它们主要诱导Th2免疫反应，并导致对接种的流感病毒株产生特异性抗体，从而提供免疫保护。然而，过去十年调查的流感疫苗的有效性并不高，平均保护率为42%（范围，19%-60%），并且在幼儿和老年人中通常更低。
为了克服幼儿和老年人的低抗体产生率，疫苗制造商已经将儿童（≥6个月大；Flulaval Trivalent/Quadrivalent, Fluarix Quadrivalent, Fluzone Quadrivalent）的季节性流感疫苗的标准HA抗原含量提高了两倍，老年人（≥65岁；Fluzone High-Dose）提高了四倍，或者使用了佐剂（仅适用于老年人；FLUAD）。这些产品已获得FDA许可，并且已经证明了改进的效力或有效性。然而，增加抗原生产的需要可能会给制造商带来负担，特别是在大流行等紧急情况下。
或者，如前所述，可以通过接种LAIV而不是IIV来增强对流感疫苗的免疫反应，或者采用新策略，例如使用皮内途径而不是注射（Sanofi Pasteur的Fluzone® Intradermal流感疫苗），因为皮肤富含APCs。尽管是相同的IIV，皮内途径与肌肉注射途径相比，使用更少的HA抗原（每株9微克）诱导了非劣的保护性免疫反应。然而，使用这些方法的FDA许可产品也尚未适用于幼儿或老年人。LAIV FluMist适用于2-49岁的人群，而Fluzone intradermal是皮内注射的，适用于18-64岁的人群。
与流感疫苗相关的不良事件从轻微症状，如注射部位的红斑、头痛、发烧、恶心和肌肉痛，到不寻常的事件，如严重过敏反应、格林-巴利综合征和眼呼吸道综合征。大多数与流感疫苗相关的不良事件都是轻微的，容易恢复。然而，针对2009年H1N1流感大流行的Pandemrix疫苗被认为与嗜睡症有关，这种由Pandemrix引起的嗜睡症与自身免疫疾病有关，但机制仍然未知。
4.2.流感疫苗开发的发展方向
对于流感疫苗，血清保护、血清转换和几何平均滴度比是考虑作为商业产品获得批准的标准。在评估疫苗的有效性时，重点是Th2免疫反应，而不是Th1免疫反应。然而，Th1和粘膜免疫反应在防御呼吸道病毒（如流感病毒）方面也起着重要作用。因此，一种在所有年龄组，包括婴儿和老年人中诱导平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，包括细胞介导和抗体反应以及涉及分泌型IgA的粘膜免疫反应，可以显著降低流感的死亡率和发病率。
如前所述，已经尝试使用各种平台（包括病毒载体、DNA载体、VLP或肽疫苗）来提高流感疫苗的效力，这些平台预计将克服当前流感疫苗的局限性，例如通过诱导更强的Th1反应和记忆反应。此外，考虑到流感疫苗株的抗原性几乎每年都会变化，并且由于抗原转移和漂移，各种流感亚型都可能引起爆发，因此正在积极研究通用流感疫苗。一种候选疫苗，包含来自流感A和B的九个保守表位的重组蛋白M-001，目前正在进行III期临床试验，预计将在2020年12月完成。基于mRNA的疫苗在SARS-CoV-2大流行期间证明了它们的潜力；因此，它们也值得考虑用于流感大流行。基于mRNA的流感病毒疫苗在小鼠中显示出保护效果，在人类临床试验中显示出免疫原性反应和安全性，并通过诱导流感病毒HA茎部特异性抗体产生交叉保护效果。AS03和MF59等佐剂已经应用于流感疫苗。然而，由于流感疫苗每年接种，因此应该大力开发新的佐剂，这些佐剂具有良好的安全性，适用于重复接种和效力，如基于RNA的佐剂。这些佐剂容易降解，如TLR3或TLR7/8配体，并且与其他在体内长时间停留的佐剂相比相对安全。
5.结论
流感疫苗相当复杂。它们根据疫苗类型（如IIV与LAIV）、接种年龄以及诱导免疫反应的机制不同而诱导不同的免疫反应，这些机制尚未完全阐明。大多数许可的疫苗主要诱导Th2型免疫反应，在幼儿和老年人中诱导的免疫反应比成人弱。因此，需要努力开发能够诱导更强大和更平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，这基于我们对随年龄变化的免疫系统的理解。
目前对流感疫苗的批准标准，侧重于Th2反应，将需要相应修改，以包括确认T细胞介导的保护。通过使用佐剂也可以实现更好的免疫反应，因此，应该开发更安全、更有效的佐剂。最后，用于预测疫苗和佐剂免疫反应的有效和可靠的工具将极大地有助于提高对流感病毒感染的保护率，不仅在成人中，而且在幼儿和老年人中也是如此。
