《Nat.Commun.》：原位喷涂治疗性水凝胶用于氧驱动Janus对术后肿瘤复发/转移和伤口愈合的调节

为了获得肿瘤靶向纳米药物(表示为HIL@Z)，将吲哚菁绿(ICG)和l -精氨酸(L-Arg)加到沸石咪唑框架(ZIF-8)纳米颗粒中，然后涂上透明质酸(HA)(图1a)。ZIF-8由于其高负载能力、定制孔径、易于制备和独特的pH响应性生物降解而被选为合适的递送载体。然后在手术部位原位构建包裹HIL@Z纳米药物和光合蓝藻(PCC7942)(表示为HIL@Z/P/H)的可喷涂海藻酸钙水凝胶(图1b)。

释放的ICG和L-Arg在肿瘤细胞内选择性内化和pH响应性分解后，在近红外(NIR)激光(808 nm)照射下，通过PDT诱导的级联反应产生ROS、NO和RNS，从而通过增加细胞内活性物质和降低GSH来破坏细胞氧化还原稳态。在红色激光(635 nm)照射下，PCC7942通过光合作用持续产生丰富的氧气，缓解了缺氧微环境，有望具有多种功能，包括i)有效增强PDT诱导的亚硝应激引发的残余肿瘤细胞死亡，防止肿瘤局部复发。ii)显著阻断细胞内HIF-1α信号通路，抑制肿瘤远处转移iii)。通过PCC 7942分泌的细胞外囊泡(EVs)有效上调血管内皮生长因子(VEGF)，从而促进血管生成和术后创面愈合过程。因此，能够预防肿瘤复发/转移和促进伤口愈合的可喷雾剂HIL@Z/P/H在癌症术后治疗中具有很大的应用前景。

图1|在癌症术后治疗中，可喷雾剂HIL@Z/P/H有效预防肿瘤复发/转移，同时促进创面愈合的示意图。a HIL@Z纳米药物的制备。b术后伤口床内喷射含有HIL@Z纳米药物HIL@Z/P/H和PCC 7942的原位形成和作用机制示意图。在红色激光照射下，HIL@Z/P/H通过光合作用产生丰富的O2，有效缓解了缺氧微环境。在肿瘤细胞中，HIL@Z纳米药物诱导的细胞内级联反应产生丰富的活性物质(ROS、NO和RNS)，降低GSH水平，同时在O2的辅助下显著下调HIF-1α，有效抑制残余肿瘤复发/转移。术后创面内通过过量生成的氧气和PCC7942分泌的EVs下调HIF-1α表达和上调VEGF水平加速创面愈合过程。

图2 |纳米颗粒的表征。a SEM, b TEM和c元素映射图HIL@Z。d不同纳米颗粒的粒径分布、e zeta势谱、f UV-vis光谱、gFT-IR光谱和h XRD谱图。i HIL@Z中ICG在不同pH值PBS中的累积释放曲线。j与HIL@Z共孵育的DPBF在410 nm近红外辐射下吸光度随时间的变化。在近红外照射和不近红外照射下通过HIL@Z生产k NO。

l用DHR表征ONOO-的荧光光谱。a、b的结果是三个独立实验的代表。e、i、k中的数据以mean±SD表示，n = 3个独立样本。源数据作为源数据文件提供

HIL@Z/P/H的制备与表征

将含有HIL@Z纳米药物和PCC 794254的CaCl2溶液和海藻酸盐溶液等体积同时喷涂制备HIL@Z/P/H。数码照片表明，不同的水凝胶被成功地制备了，小瓶翻转测试证明了这一点(图3a)。流变试验结果表明，水凝胶的储存模量(G′)和HIL@Z/P/H始终大于其损失模量(G″)，进一步说明了它们的水凝胶特性。此外，高倍伪彩色SEM图像显示，HIL@Z纳米颗粒(蓝色)和PCC 7942(绿色)均匀分布在HIL@Z/P/H的微孔网络结构中(图3b)。PCC 7942对水凝胶形态几乎没有影响。这些结果进一步验证了HIL@Z纳米颗粒在HIL@Z/P/H中的包封成功。同时，荧光图像进一步表明PCC 7942成功封装到HIL@Z/P/H中，红色自荧光PCC 7942分布均匀(图3d)。不同天数P/H所得PCC 7942均生长良好，菌落数量无明显差异(补充图19)。此外，HIL@Z/P/H的光合行为在贮藏15天后几乎没有明显的退化(图3e)。并且HIL@Z/P/H在激光反复开关循环测试中仍能产生相同数量的O2(图3f)。结果表明，HIL@Z/P/H包封的PCC 7942具有良好的光合产氧稳定性。

图3 |喷雾剂HIL@Z/P/H的特性及光合产氧能力。a不同水凝胶凝胶化前后的照片。

b不同放大倍数下HIL@Z/P/H的SEM图像(附图:HIL@Z/P/H冻干后的照片)。c HIL@Z/P/H的元素映射图。d HIL@Z/P/H荧光图像。e HIL@Z/P/H在不同天数的储存过程中释放的溶解氧。f光触发循环O2生成HIL@Z/P/H。b、d的结果是三个独立实验的代表。

图4 |体外细胞吞噬和细胞氧合。a不同纳米颗粒处理B16F10细胞的荧光图像。b不同纳米颗粒处理B16F10细胞Rhm b信号的流式细胞术分析和c相应的平均荧光强度(MFI)。B16F10细胞与HIL@Z孵育2.5 h (d)和4 h (f)的荧光图像。蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表Rhm B，绿色荧光代表Lyso-Tracker。e和g分别为d和f中白色箭头处荧光强度的线扫描分布图。h Ru(dpp) 3cl2染色B16F10细胞不同处理后的荧光图像及其对应的荧光强度。j不同处理后B16F10细胞HIF-1α/MMP-9蛋白表达的Western blotting (WB)分析。k实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析不同处理后B16F10细胞HIF-1α mRNA的表达。a、d、f的结果是三个独立实验的代表性结果。c、i、k中的数据以mean±SD表示，n = 3个生物独立样本。P值通过多重比较单因素方差分析方法t检验计算。

图5 | HIL@Z/P/H对B16F10细胞抗癌作用的体外评价。a不同浓度HIL@Z/P/H共培养HUVECs和B16F10细胞的相对细胞活力。b不同处理后B16F10细胞的相对细胞存活率。c不同组B16F10细胞活/死染色荧光图像。d流式细胞术分析不同组B16F10细胞凋亡情况。e早期凋亡、凋亡和坏死的B16F10细胞群。f B16F10细胞内ROS、NO和RNS检测的荧光图像。g, j不同处理后DCFH-DA (ROS荧光探针)染色B16F10细胞的流式细胞术测定及相应的MFI。h, k不同处理后DAF-FM DA (NO荧光探针)染色B16F10细胞的流式细胞术测定及相应的MFI。i, l不同处理后B16F10细胞用DHR (ONOO -荧光探针)染色的流式细胞术测定及相应的MFI。c、f的结果是三个独立实验的代表。a、b、j - 1中的数据以mean±SD表示，n = 3个生物独立样本。P值通过多重比较单因素方差分析方法t检验计算。

团队建立肿瘤不完全切除模型，进一步研究HIL@Z/P/H对肿瘤残余细胞局部复发的抑制作用。团队发现HIL@Z/P/H+Red+NIR组创面在第14天逐渐闭合甚至愈合，而其他组创面几乎不愈合且结痂明显(图6b)。此外，HIL@Z/P/H+Red+NIR组创面收缩效果优于其他组，未闭合创面面积较小。进一步验证了其良好的促创面愈合活性。HIL@Z/P/H+Red+NIR组肿瘤体积明显减小，而其他7组肿瘤生长速率不受控制地持续增加。更重要的是，HIL@Z/P/H+Red+NIR组部分肿瘤甚至消失，无复发(图6c-e)。此外，得益于良好的肿瘤抑制效果，HIL@Z/P/H+Red+NIR组小鼠寿命明显延长，42天内存活率最高(80%)(图6)。

图6 | HIL@Z/P/H在黑色素瘤不完全切除模型上的体内抗肿瘤性能。在不完全黑色素瘤切除模型中HIL@Z/P/H抑制肿瘤复发的示意图。b不同组在14天治疗期间的肿瘤/伤口部位照片。c第14天不同治疗后的切除肿瘤照片。d组肿瘤体积变化、e组肿瘤重量变化、f组小鼠存活率变化、g组H&E、TUNEL、Ki67和HIF-1α染色肿瘤切片及h-j定量分析。

照片显示肺组织转移性结节(红色圆圈)。治疗:(1)控制,(2)红色+近红外光谱,(3)HIL@Z / P / H (4) HL@Z / P / H +近红外光谱,(5)HI@Z / P / H +近红外光谱,(6)HIL@Z / P / H +红色,(7)HIL@Z / P / H +近红外光谱,(8)HIL@Z / P / H +红色+近红外光谱。g、k的结果代表了三只独立的小鼠。d-f、h-j中的数据以mean±SD表示，h-j中n = 3只生物独立小鼠，d-f中n = 5只生物独立小鼠。P值通过多重比较单因素方差分析方法t检验计算。

图7 | PCC 7942的体外促血管生成性能a P/H促进创面愈合的示意图。b PCC 7942分泌ev的TEM图像。

c PCC 7942分泌EVs的水合粒径分布。d, e HUVEC迁移的代表性图像及量化。f-h HUVECs管状形成的代表性图像及结节和节点的量化。b中的结果代表了三个独立的实验。e、g、h中的数据以mean±SD表示，n = 3个生物独立样本。P值通过多重比较单因素方差分析方法t检验计算。

图8 | HIL@Z/P/H对伤口愈合的体内促进作用。HIL@Z/P/H促进全层皮肤缺损小鼠模型创面愈合的示意图。b皮肤创面照片，c未愈合创面痕迹，(d)治疗期间各组创面面积定量分析。e不同组伤口完全闭合时间。f各组创面第12天H&E、Masson染色。第12天各组细胞g上皮厚度和i胶原沉积的定量测定。d、e、g、i中的数据用mean±SD表示，d、g、i中n = 3只生物独立小鼠，e中n = 5只生物独立小鼠，P值采用多比较单因素方差分析方法t检验计算。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-45072-x