肠道菌群影响缺血再灌注损伤中程序性细胞死亡水平的研究进展

1兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2兰州大学第一医院麻醉科，兰州 730000；3山西医科大学汾阳学院临床医学系，汾阳 032200

国家自然科学基金（82260381）

【综述】

肠道微生物群是以一定比例分布于肠道内的数以万亿计的微生物，成年人肠道微生物群包含250多种不同种类的细菌、真菌、病毒和古细菌。肠道菌群及其代谢物既在人体的免疫、代谢和神经系统方面发挥重要作用，还通过肠‑脑轴和肠‑肝轴对脑、肝等重要器官产生影响。如乳杆菌和双歧杆菌能降低促炎性细胞因子白细胞介素（interleukin, IL）‑6和IL‑17水平。在一项前瞻性的临床研究中，28.9%的耐药性癫痫患者经过4个月的益生菌混合物治疗，癫痫发作频率降低，并在停药4个月后，76.9%的患者仍保持了较低的发作频率。此外，越来越多的研究表明，肠道菌群及其代谢物在缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）相关的程序性细胞死亡（programmed cell death， PCD）中扮演重要角色。

组织器官在缺血后血液再灌注，不仅不能恢复其功能，反而进一步加重缺血引起的代谢障碍和结构破坏，这种现象被称为IRI。组织器官长期缺血期间，由于低氧代谢和乳酸积累，细胞内离子转运机制功能失调，导致细胞内和线粒体内的钙离子超载、细胞肿胀破裂，激活凋亡、自噬、铁死亡等PCD机制，从而加剧组织损伤。以IR为特征的疾病（如心肌梗死、脑卒中、外周血管疾病）是导致危重症疾病和死亡的最常见原因。研究表明肠道菌群及其代谢物在IRI相关PCD过程中扮演重要的角色。

PCD是由细胞内特定基因调控的分子程序介导的细胞死亡过程。迄今为止，已经深入研究了至少5种主要的PCD类型（凋亡、焦亡、自噬、铁死亡等）。IRI过程中涉及多种不同类型的PCD，这些细胞死亡不仅局限于肠本身，还包括肠外远端器官的损伤，尤其是血液供应丰富的心脏、肝、肾和大脑等。许多临床试验表明，PCD是IRI的一个重要组成部分，如动脉粥样硬化患者中焦亡相关因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白（NOD‑like receptor thermal protein domain associated protein， NLRP）3水平明显升高。通过干预PCD水平可以影响IRI的程度，例如卡托普利通过降低心肌氧化应激和凋亡水平，减轻心脏瓣膜置换手术患者的心肌IRI。最近的研究发现，肠道菌群及其代谢物与IRI的发生、发展息息相关，它们通过调节炎症、氧化应激、介导PCD等影响IRI。

2.1　凋 亡

细胞凋亡是多细胞生物中最常见的PCD形式，由起始物含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）‑8、caspase‑9、caspase‑10和效应物caspase‑3、caspase‑6、caspase‑7之间的平衡被破坏，从而激活，最终导致细胞骨架早期降解，而细胞膜保持完整，无细胞内容物释放，无炎症表现。细胞凋亡主要通过内源性或外源性两种途径被激活，内源性途径的特点是线粒体外膜透化，由B淋巴细胞瘤‑2（B‑cell lymphoma‑2， Bcl‑2）家族的Bcl‑2拮抗因子和Bcl‑2相关X蛋白的寡聚化激活，导致细胞色素C和其他凋亡调节蛋白（如Smac/Diablo）的释放，从而激活caspase的胞内酶级联反应，最终导致细胞凋亡；外源性途径是由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）受体家族、死亡受体家族和TNF相关的凋亡诱导配体受体家族激活，形成死亡诱导信号复合体，进而激活caspase酶级联反应，最终导致细胞凋亡。

IRI发生细胞凋亡，而微生物及代谢物影响着细胞凋亡水平。Caco‑10细胞用双歧杆菌处理后，有效抑制了TNF‑α诱导的细胞凋亡；丁酸盐是肠道菌群代谢物短链脂肪酸中研究最深入全面的代谢物，血管平滑肌细胞加入丁酸盐后，丁酸盐抑制了蛋白激酶B的磷酸化依赖性活化，致使caspase‑3被抑制和多腺苷二磷酸核糖聚合酶水平下调，减少细胞凋亡，这些实验表明在细胞水平上肠道菌群能够影响细胞凋亡。实验动物模型上同样发现肠道菌群的影响，IR小鼠模型中发现嗜酸乳杆菌降低了caspase‑3、Bcl‑2相关X蛋白、Bcl‑2、高迁移率族蛋白B1的水平，减轻了肾损伤；在大鼠心肌梗死模型中口服活的益生菌菌株能抑制TNF‑α水平，改善心功能。以上实验说明肠道菌群及代谢物对IR诱导的上皮样细胞凋亡有抑制作用。

除了有益作用，也有研究证明微生物代谢物可以加重细胞凋亡，如丁酸盐作用于牛肾上皮细胞后，激活了caspase‑3并诱导乙酰化组蛋白的积累，加重细胞凋亡。这与上述丁酸盐抑制caspase‑3活性并使细胞凋亡水平降低的结果相反，说明丁酸盐对细胞凋亡的作用效果可能有两面性，需要更多实验来验证。

2.2　焦 亡

焦亡是细胞中的一种程序性炎性坏死过程，它介导多种caspase的激活。焦亡可通过激活孔形成蛋白家族gasdermins之一的蛋白质，即消皮素D（gasdermin D, GSDMD），导致GSDMD的寡聚化，形成细胞膜上的孔。这些孔使成熟的IL‑1β、IL‑18、caspase‑1能够通过，最终导致膜破裂和促炎性细胞因子NLRP3、NLRP6、凋亡相关斑点样蛋白、caspase‑1的释放。尽管焦亡与细胞凋亡同样在细胞膜表面出现大量气泡并激活caspase‑3、caspase‑6、caspase‑8、caspase‑9，但不同之处在于焦亡还能激活caspase‑1、caspase‑4、caspase‑5、caspase‑11，且在质膜破裂前，细胞因质膜渗漏导致胞质扁平化。焦亡主要由经典和非经典两种路径激活。经典途径由炎症小体NLRP1或NLRP3介导，随后NLRP招募凋亡相关斑点样蛋白和caspase‑1前体并活化，活化的caspase‑1不仅可以切割GSDMD形成N‑GSDMD诱导焦亡，还可以将IL‑1β、IL‑18的前体加工成成熟的IL‑1β、IL‑18，并通过N‑GSDMD形成的孔释放出来。非经典途径中，细胞质中的脂多糖激活caspase‑4、caspase‑5、caspase‑11，并通过NLRP3/caspase‑1通路引发焦亡。

肠道菌群及其代谢物复杂多样，其作用于焦亡的结果也不尽相同。研究发现，外源加入丁酸钠可以通过caspase‑1/GSDMD经典焦亡途径抑制肾小球内皮细胞焦亡，从而减轻肾损伤。然而，由肠道菌群代谢产生的三甲胺N‑氧化物却能激活多种细胞的NLRP3炎症小体，提高活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，从而促使血管内皮细胞焦亡，加速高脂饮食下脂蛋白e缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变进展。这些研究结果的不同可能是由于不同个体肠道菌群数量、种类和代谢物水平的差异引起，因此在调节器官或组织IR诱导的焦亡水平时，需重视肠道菌群及其代谢物的作用。

2.3　自 噬

自噬是维持细胞氧化平衡和生存的重要内源性保护机制，真核细胞通过这一机制将潜在危险的胞质成分输送到溶酶体进行降解。自噬主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，巨自噬在其中占有重要地位。在巨自噬启动过程中，由于单磷酸腺苷水平升高，导致生物能量受到应激，最终使腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'‑monophosphate ‑activated protein kinase, AMPK）激活，雷帕霉素复合物1的磷酸化靶点失活，以及参与激活起始和成核的多种分子的去磷酸化。unc‑51样自噬激活激酶1、AMPK和雷帕霉素复合物1相关的磷酸化/去磷酸化事件通过生成超分子复合物触发了吞噬泡成核，且该超分子复合物具有磷脂酰肌醇3‑激酶（phosphoinositide 3‑kinase, PI3K）活性。吞噬泡的延伸涉及两个泛素样蛋白连接系统：一方面，自噬相关基因（autophagy related gene， ATG）7、ATG10在催化ATG12‑ATG5‑ATG16复合物的形成过程中发挥作用；另一方面，ATG4、ATG7、ATG3协同切割微管相关蛋白轻链3（microtubule‑associated protein light chain 3， LC3）的前体，将其转化为成熟的LC3形式，随后与磷脂酰乙醇胺结合，借助磷酸肌醇相互作用蛋白的支持形成自噬体。因此，在细胞自噬过程中AMPK、ATG、LC3和雷帕霉素等多个因子发挥着至关重要的作用。

肠道菌群及其代谢物对自噬有不同的影响：一方面小鼠细胞实验表明，丁酸钠通过PI3K/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白相关途径增强ATG介导的自噬（增加LC1B‑Ⅱ和降低p1表达），短链脂肪酸通过过氧化物酶体增殖物活化受体γ刺激解耦联蛋白2的表达诱导自噬，这与细胞内三磷酸腺苷水平的降低和蛋白激酶单磷酸腺苷激活的催化亚基alpha1/AMPK的激活有关；另一方面，研究证明双歧杆菌通过抑制自噬相关标志物的表达，改善了TNF‑α诱导的结直肠腺癌细胞的自噬。Zhu等的研究也发现，调节肠道菌群可以影响肝细胞自噬，从而改善肝IR所致的肝损伤。这些研究表明肠道菌群能通过多种途径作用于IRI相关的细胞自噬。

2.4　铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡形式，通常伴随铁的过量积累和脂质过氧化。铁死亡诱导因子可通过不同途径直接或间接地影响谷胱甘肽过氧化物酶，导致抗氧化能力降低和ROS积累，最终导致细胞死亡。这种细胞死亡表现为线粒体体积减小，线粒体嵴减少或消失，但细胞膜保持完整且胞核大小正常。随着研究的深入，已经发现了3种调节铁死亡的途径，其中，胱氨酸/谷氨酸反向转运体/谷胱甘肽（glutathione，GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）是研究最完善的途径，该途径由跨膜胱氨酸/谷氨酸反向转运体systemXc‑将胱氨酸还原为半胱氨酸入胞，经作用生成GSH。GPX4在铁死亡过程中发挥关键作用，它可以将GSH转化为氧化型谷胱甘肽，从而减少ROS的生成，保护细胞免受脂质过氧化的损害。

尽管铁死亡是近年来新发现的细胞死亡方式，肠道微生物及代谢物对铁死亡作用的研究仍相对较少。但Deng等在对体外循环患者进行的临床研究发现，辣椒酸盐（capsiate, CAT）作为肠道菌群代谢物，体外循环患者术前粪便中的CAT水平与肠道IRI之间呈负相关，由此进一步研究揭示了CAT通过激活非选择性阳离子通道辣椒素受体来增强GPX4表达，抑制铁蛋白生成，从而减轻肠内外铁死亡，为管理肠道IRI提供了潜在途径。另一方面，Song和Long的研究发现，核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid2‑related factor 2, Nrf2）和血红素加氧酶1（heme oxygenase‑1, HO‑1）可以参与GPX4的合成，Nrf2能通过调节溶质载体家族7成员11缓解铁死亡介导的IR诱导的急性肺损伤，这表明Nrf2和HO‑1在IRI相关铁死亡中也发挥一定作用。丁酸钠作为Nrf2激活剂，可以促进Nrf2基因表达，提高其下游靶标HO‑1表达。

2.5　铜死亡

铜死亡是最近发现的一种由过量铜引发的调节性细胞死亡形式，这种铜诱导的PCD形式与其他细胞死亡途径不同，它由细胞内铜靶向结合三羧酸循环中的脂酰化组分，在这一过程中，铜结合的脂酰化线粒体蛋白发生聚集，随后铁硫簇减少，诱导蛋白毒性应激并最终导致细胞死亡。线粒体铁氧还蛋白和脂酰合酶已被确定为铜死亡的关键调节因子。铁氧化还原蛋白1或脂酰合酶的基因敲除将导致丙酮酸和α‑酮戊二酸的积累，减少蛋白质脂酰化并抑制铜诱导的细胞死亡。

因铜死亡相关的研究时间较短，目前尚未有关于肠道菌群对IR诱导的铜死亡的相关研究。但Li等发现，双硫仑/铜可以通过ROS/促分裂原活化的蛋白质激酶和p53途径介导铁死亡的发生。此外，Yang等在对铜离子的研究中也发现了铜离子对铁死亡的诱导作用。这说明铜死亡和铁死亡之间存在联系，为未来的研究提供了方向。

2.6　其 他

坏死性凋亡是一种具有被动和主动促炎功能的调节性细胞死亡，它通常在死亡受体和Toll样受体4或Toll样受体3的下游被触发。激活后，这些受体募集衔接蛋白（死亡域蛋白、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白、β干扰素TIR结构域衔接蛋白）和受体相互作用蛋白激酶1（receptor‑interacting protein kinase, RIPK）1和caspase‑8或caspase‑10相互作用，募集RIPK3形成RIPK1‑RIPK3复合物并磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain‑like protein, MLKL），使MLKL寡聚化，从而形成坏死体，最终使细胞肿胀、膜裂解、胞内物质释放，导致细胞死亡。这表明RIPK3磷酸化MLKL是坏死性凋亡的标志事件，抑制RIPK1或RIPK3的水平对减轻坏死性凋亡至关重要。

坏死性凋亡作为已知时间较长的PCD方式，还没有关于肠道菌群对IRI相关坏死性凋亡的研究。这提供了一个潜在的IRI相关的研究方向。

肠道微生物作为人体重要组成部分影响着多种代谢水平的变化，而随着对PCD研究的深入，肠道菌群在IRI相关PCD中的作用越来越受到关注，肠道菌群和其代谢物通过多种途径影响凋亡、自噬、焦亡、铁死亡等不同类型的PCD，从而影响IRI相关疾病的发生率。但因肠道菌群的复杂性、个体差异性，以及细胞死亡之间的联系，对不同死亡方式的促进和抑制结果不尽相同，深入研究和探讨这些结果的发生原理有助于更好地认识IRI，也为未来的临床治疗提供新思路。

目前肠道菌群影响IRI相关PCD的结果更多着眼于细胞和动物实验，在临床实践中尚未形成公认的证据。然而已有的实验证明了IRI相关PCD的重要性。调整个体肠道菌群及其代谢物的水平以减轻PCD，或许是未来治疗IR高风险患者的新方向。

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国际麻醉学与复苏杂志

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