天然药物靶向铁死亡缓解脑缺血再灌注损伤的研究进展

1陕西中医药大学第二临床医学院，咸阳 712046；2西安交通大学附属红会医院麻醉科，西安 710054

西安市创新能力强基计划‑医学研究项目（22YXYJ0019）

【综述】

尽早恢复组织血流是治疗缺血性脑病变的首要目标，但随着灌注恢复会出现继发性脑损伤，这一现象称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）。目前CIRI的预防与治疗缺乏有效的措施。CIRI病理机制复杂，涉及氧化应激、钙超载、炎症反应、兴奋性氨基酸增多、细胞凋亡等。铁死亡由Dixon等在2012年首次提出，是一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式。铁稳态失衡和脂质过氧化物累积是铁死亡的关键环节。近年来，越来越多的证据表明铁死亡在CIRI中起着关键作用。本文就铁死亡在CIRI中的病理机制及CIRI中靶向铁死亡的天然药物研究展开综述，以期为缓解CIRI提供新思路和新方法。

研究发现，CIRI脑组织中可检测到游离铁累积，铁超载造成线粒体氧化磷酸化途径异常激活，在合成ATP的同时产生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS），促使细胞死亡。Guo等在大鼠CIRI模型中发现，神经功能缺陷常伴有铁死亡的典型分子特征，包括铁异常累积和脂质过氧化物增加。铁死亡抑制剂铁抑素‑1和脂抑素‑1能显著缓解大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）诱导的小鼠神经元损伤。

1.1　铁代谢异常

铁是人体微量元素之一，在氧气运输、DNA合成和能量代谢中发挥重要作用，也是髓鞘形成和神经递质合成所必需的，对维持神经元正常功能至关重要。细胞中过量的Fe2+通过芬顿反应产生更多的自由基，促使脂质过氧化，导致铁死亡，另外，Fe2+参与脂氧合酶的合成进而催化多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）氧化导致铁死亡。

胞内游离铁排出受限和细胞对铁的摄取增加会导致神经元内铁过载。铁的异常积累在铁死亡的发展中至关重要。在以小鼠为研究对象的心搏骤停复苏模型中发现，骤停前增加细胞内铁会恶化心肺复苏后的神经功能，而降低细胞内铁可改善神经功能。在成年大鼠心搏骤停复苏模型中发现，复苏后2 h血浆中神经元特异性烯醇化酶显著升高，同时血浆中铁浓度显著下降。循环铁浓度是否可以作为CIRI程度和预后判断的标志物值得未来深入研究。

1.2　脂质代谢异常

脂质过氧化物的异常积累是铁死亡的特征之一。在活性铁的存在下，细胞膜富含的PUFA通过酶或非酶过氧化反应转化为磷脂过氧化物，而磷脂过氧化物的过多积累会破坏膜结构的完整性导致细胞死亡。研究证实，一些脂溶性抗氧化剂，如α‑生育酚、铁抑素‑1和依达拉奉等，可以通过去除脂质过氧化物而缓解铁死亡。酰基辅酶a合成酶长链家族成员4（acyl‑CoA synthetase long‑chain family member 4, ACSL4）是PUFA代谢的重要同工酶，敲低ACSL4对小鼠脑缺血有保护作用，而过表达ACSL4则通过增强脂质过氧化作用诱导铁死亡进而加重脑损伤。PUFA发生脂质过氧化被认为是铁死亡的关键环节，而单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFA）已被证明是铁死亡的有效抑制剂。脂质代谢正是通过调节MUFA和PUFA之间的平衡影响磷脂的组成，从而影响细胞对铁死亡的易感性。总之，不受控制的脂质过氧化和继发于脂质过氧化的活性醛的产生最终导致细胞膜破裂和细胞死亡。

1.3　氨基酸代谢异常

氨基酸代谢异常与铁死亡的发生密切相关。支链氨基酸（branched chain amino acid, BCAA）是人体不可缺少的营养物质，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。高水平的BCAA可促进脂质过氧化，诱导细胞死亡。研究表明，CIRI后BCAA代谢受抑制，BCAA的累积导致氧化应激与脂质过氧化，同时BCAA也会影响铁死亡相关基因和蛋白表达发生变化，从而诱导铁死亡。

胱氨酸是一种非必需氨基酸，在谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成、蛋白质半胱氨酸化、硫化氢和能量产生等代谢途径中发挥积极作用。胱氨酸对机体的抗氧化和自由基清除功能很是关键，在所有氨基酸都存在的情况下，仅胱氨酸缺乏即可导致铁死亡。近期研究发现，胱氨酸可激活氨基酸介导的GTP酶重组激活基因复合物-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1-4E-BP蛋白家族信号轴，促进谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）蛋白合成，以不依赖GSH的方式抑制细胞铁死亡。溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）是铁死亡的关键调节蛋白，SLC7A11的下调可通过抑制半胱氨酸代谢通路，引起细胞内胱氨酸水平降低和GSH生物合成耗竭，进而导致脂质过氧化物堆积，最终诱导细胞发生铁死亡，而逆转CIRI中SLC7A11的表达，有助于缓解神经元损伤。

CIRI是卒中的普遍特征，其常规治疗费用昂贵且周期长。天然药物因来源多、生物活性多及作用靶点多渐渐受到研究者们的关注。已有研究表明，某些天然药物及其提取物或不同天然药物的复方制剂可以通过调节铁死亡，预防和控制CIRI，从而达到缓解和治疗CIRI的目的。

2.1　天然药物靶向铁死亡缓解CIRI

丹参是一种传统的中草药，几百年来被用于治疗包括心脑血管疾病在内的多种疾病。CIRI后给予小鼠连续3 d、每天1次200 mg/kg的丹参口服，结果早期（3 d）和长期（28 d）的神经损伤都得到显著改善，机制上丹参干预降低了丙二醛（malondialdehyde, MDA）、铁蛋白和ACSL4水平，并且显著升高脂质修复功能生物标志物GSH和GPX4水平，同时Perls染色显示丹参干预显著降低了梗死灶周围铁沉积数量。与丹参主要靶向脂质代谢抑制铁死亡不同，黄芪通过靶向铁代谢抑制铁死亡，缓解术后神经功能缺损。黄芪处理显著降低MCAO后大鼠铁蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体、二价金属转运蛋白‑1表达，并上调铁泵蛋白Ferroportin1的表达。与丹参一样，长期服用黄芪对MCAO诱导的脑损伤有远期的神经保护作用。三七传统上用于散瘀止血、消肿止痛，在干预MCAO模型大鼠后观察到，皮质组织中Fe2+、MDA、白细胞介素‑1β、肿瘤坏死因子‑α、白细胞介素‑6含量显著降低，GSH、GPX4含量显著升高，这提示三七除了传统功效外，还可以靶向铁代谢和脂质代谢，缓解CIRI后的神经损伤。

2.2　天然药物靶向铁死亡缓解CIRI

天然药物来源于天然资源，来源广、费用成本低。随着现代生物技术的发展，天然资源中的有效药用成分不断被认识和研究。

二氢杨梅素（dihydromyricetin, DHM）是一种广泛存在葡萄科植物中的类黄酮化合物。体内外实验均证实，DHM通过抑制脂质氧化和降低胞内铁离子水平靶向铁死亡可改善CIRI，实验进一步证实DHM通过抑制鞘氨醇激酶1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制铁死亡。黄芩素是传统中药黄芩的主要成分，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性。研究证实，黄芩素通过GPX4/ACSL4/酰基辅酶a合成酶长链家族成员3轴抑制体内外铁死亡，改善CIRI，表现在黄芩素提高了小鼠缺氧缺糖/复氧复糖细胞活力，降低MCAO小鼠脑组织铁代谢和脂质过氧化水平及改善铁死亡的形态特征。同时黄芩根提取物的黄芩苷也被证实可抑制脂质过氧化和铁死亡相关蛋白表达，改善C57BL/6J小鼠CIRI引起的认知功能损害。动物来源的提取物也得到学者们的关注。角鲨烯是鲨鱼肝脏中提取的三萜类天然化合物，具有抗氧化、抗炎和降低胆固醇等功效。研究提示，角鲨烯可显著缓解CIRI并呈剂量依赖性，可能的机制是角鲨烯降低了再灌注脑组织中铁离子含量，降低脂质代谢中ACSL4蛋白的表达并上调抗氧化蛋白SLC7A11和GPX4的表达。

总之，天然药物提取物是目前和未来研究干预CIRI的热点，天然药物提取物的脑保护作用与调控铁死亡相关的铁代谢、脂质代谢和氧化水平靶点均有关，这样的特点显示出天然药物提取物在未来预防与治疗CIRI的巨大潜力。

2.3　天然药物组合物靶向铁死亡缓解CIRI

2.3.1　补阳还五汤

补阳还五汤出自清代王清任《医林改错》一书，由黄芪、归尾、赤芍等组成，常用于卒中等脑血管疾病的治疗。刘英飞等研究发现，补阳还五汤能改善MCAO小鼠神经学评分及脑组织病理形态，降低脑组织铁、MDA含量，增加GPX4蛋白表达，这提示补阳还五汤可能通过抑制铁死亡缓解CIRI，进一步研究发现补阳还五汤也通过小窝蛋白-1抑制铁死亡。陈俊等在临床研究中发现，补阳还五汤通过激活核因子红系2相关因子2‑GPX4通路抑制铁死亡，改善脑卒中患者的认知功能。另外，学者们应用网络药理学分析提示补阳还五汤通过不同药物间的协同作用，调控铁死亡以缓解CIRI，关键的作用机制是HSP90AA1靶点以及磷脂酰肌醇3激酶‑蛋白激酶B信号通路。补阳还五汤中的君药黄芩靶向铁死亡缓解CIRI的作用已得到证实，而复合其他药物是否增强了黄芩抑制铁死亡的效果同时降低其副作用的问题有待后续更多研究证实。

2.3.2　脑泰方

中医对卒中的病因解释为气血逆乱，脑络痹阻。脑泰方由黄芪、川芎、地龙和僵蚕四味药组成，具有益气活血的功效，其在卒中的治疗中取得良好的临床效果。实验证实脑泰方可有效改善MCAO模型大鼠的神经功能，增强梗死区域恢复，且0.9 g/kg脑泰方灌胃效果更显著。更深入研究脑泰方靶向铁死亡的具体环节结果提示，在调控铁代谢方面，脑泰方通过上调热休克转录因子1/热休克蛋白β‑1通路，抑制神经元铁的吸收和增加铁蛋白的铁存储以调控铁稳态，进而抑制ROS产生及随后脂质过氧化产物引起的MCAO大鼠神经元铁死亡。进一步研究发现脑泰方可以上调铁蛋白转运蛋白1的表达，下调Smad同源物4和铁调素的表达，促进神经元铁外排，从而抑制MCAO大鼠海马CA2区铁下沉。在调控氨基酸代谢方面，贺运河等发现脑泰方降低沙鼠再灌注后大脑皮质谷氨酸、天冬氨酸含量，显著升高甘氨酸、牛磺酸、γ‑氨基丁酸含量，并且表现出剂量效应。另一研究提示，脑泰方提高了沙鼠脑组织谷氨酸转运体的功能，增加谷氨酸的摄取，从而降低突触间谷氨酸含量。在脑的缺血性病变中，过量ROS产生会引起脂质和蛋白质过氧化，导致细胞死亡，降低ROS水平有助于抑制铁死亡。脑泰方干预明显降低MCAO大鼠脑组织中铁、MDA及ROS水平，进一步研究发现脑泰方通过抑制转铁蛋白受体1/二价金属转运蛋白‑1信号通路和激活SCL7A11/GPX4信号通路促进MCAO大鼠抑制铁死亡缓解神经损伤。

脑组织缺氧/缺血导致神经元死亡，死亡的神经元释放大量铁离子，过多的铁离子又导致自由基产生和氧化损伤，引起更多神经元死亡。这些过程会不断循环，最终引起脑组织萎缩和功能丧失。尽管目前明确铁代谢、脂质代谢和氨基酸代谢的异常导致铁死亡，但靶向铁死亡缓解CIRI仍然存在许多挑战。一方面，铁死亡的特异性标志物目前并不明确，各种代谢途径的相互影响也不明确。另一方面目前靶向铁死亡缓解CIRI的研究以细胞和动物模型为主，缺乏临床应用研究。因此，不断探索铁死亡的机制和具有临床应用价值的干预措施是未来热点。

目前常用的铁死亡抑制剂大多选择性调控铁死亡环节中的某一方面，而天然药物生物活性多，作用机制多，对铁死亡的多个环节均有抑制作用。尤其中药复方制剂利用独特的君臣佐使理论使不同药物发挥协同作用，表现出调控铁死亡、缓解CIRI的广阔前景。另外，天然药物来源广，药用开发成本低，一旦成功在临床推广使用，可极大降低患者和社会的医疗支出。

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