NC | 西南大学&华中农业大学研究团队合作揭示截短的BBX18转录因子赋予现代栽培番茄干旱敏感性的作用机制

文摘 2024-10-25 06:31 法国

番茄是全球重要的蔬菜作物，原产于南美洲安第斯山脉的干旱地区。与野生番茄相比，经过自然变异和人类驯化后的大多数栽培番茄已经变得对干旱敏感，这不利于番茄产量。探索番茄抗旱性退化的遗传基础和分子机理以及挖掘对番茄抗旱性有贡献的基因，对于通过利用生物技术工具来加速番茄抗旱品种的选育具有现实意义。

B-box（BBX）蛋白家族是一类独特的锌指转录因子（TFs），通过与基因启动子区的特异顺式作用元件结合从而激活或抑制基因转录，在植物生长发育和对环境刺激的响应中起关键作用。然而，尚不清楚BBX基因与番茄在进化过程中抗旱性的丢失是否存在关联。

2024年9月13日，西南大学园艺园林学院李金华教授团队和华中农业大学园艺林学学院张俊红教授团队联合在Nature Communications上发表题为“A truncated B-box zinc finger transcription factor confers drought sensitivity in modern cultivated tomatoes”的研究论文。研究使用基因芯片分析确定了一个参与番茄抗旱性调节的天然存在的BBX18变异体。

BBX18在番茄进化中被负向选择，编码区265位的SNP（C→T）不仅导致其翻译提前终止，更使其转录抑制活性丧失，敲除BBX18会导致栽培番茄抗旱性增强。BBX18相互作用番茄的抗旱性正调节因子APX1，并结合其启动子的顺式作用元件抑制其表达。研究结果揭示了一种抗旱性调节机制，为研究其他植物物种的抗旱性提供了思路。

BBX18中的SNP-265是转录激活活性的关键SNP位点

先前的研究从以干旱敏感的栽培番茄M82为轮回亲本构建的潘那利番茄基因渐渗系群体中鉴定了两个抗旱渐渗系IL2-5和IL9-1，这为挖掘抗旱性QTLs提供了条件。为此，研究分析了干旱胁迫下IL2-5和IL9-1相较于M82的DEGs，发现它们通常位于从潘那利番茄遗传的染色体片段中，SlBBX18（Solyc02g084420.2）是其中一个下调明显的DEG。

SlBBX18位于番茄基因组的2号染色体，其两翼存在RFLP标记。此外，BBX18所在的BAC克隆位于染色体2-I中的IL片段，这些证据强调了SlBBX18作为耐旱性主效QTL的可能性。研究克隆了M82（SlBBX18）和潘那利番茄LA0716（SpBBX18）中BBX18的全长编码序列，它们高度相似，仅存在SNP-265和SNP-328两个突变（图1a）。有趣是，SNP-265因为终止密码子（TAG）导致SlBBX18翻译提前终止，而SNP-328仅导致单个氨基酸的替换。

SlBBX18和SpBBX18都主要定位于细胞核（图1c），与它们作为TFs的作用相一致。有意思的是，只有SlBBX18在酵母实验中表现出转录激活效应，而SpBBX18不能，且这种转录激活活性由SlBBX18的N端决定（图1b）。进一步的，在将SpBBX18的SNP-265（C）和SNP-328（C）分别转化为T之后，pBD-SpBBX18-C265T表现出转录激活，而pBD-SpBBX18-C328T没有导致转录激活（图1d）。此外，在植物系统中，融合了Gal4 DBD的SlBBX18能显著激活LUC表达，而SpBBX18反而抑制了LUC表达（图1e）。这些结果强调了SlBBX18和SpBBX18的转录活性差异，并突出了SNP-265对BBX18转录激活活性的重要性。

图1. BBX18等位基因及其转录激活活性

抗旱性和BBX18等位基因在番茄进化过程中被负向选择

为了了解SNP-265和BBX18等位基因在番茄进化中的选择情况，研究选取了53份醋栗番茄（PIM）、108份驯化樱桃番茄（CER）和160份改良栽培番茄（BIG）为材料进行了BBX18的SNP分析。分别有98%的PIM和69%的CER番茄表现出BBX18^CC纯合等位基因型，而仅有28%的BIG番茄是BBX18^CC纯合等位基因型。相反，BIG中携带BBX18^TT纯合等位基因的占67%（图2a）。此外，根据对BBX18的变异分析，BBX18位点在候选番茄驯化清除中没有被选择（图2b）。

然而，对选择的38份番茄种质进行干旱胁迫处理后，PIM组的存活率显著高于CER和BIG组，同时携带BBX18^CC基因型的番茄存活率也高于那些带BBX18^TT基因型的（图2c-d），这说明BBX18在番茄进化过程中受到了自然选择的影响，且是负向选择。

图2. 番茄种质资源调查中耐旱性状与BBX18 C265T变异的相关性

BBX18负调控番茄抗旱性

M82和潘那利番茄中，BBX18均在地上组织，尤其是茎、叶和花中具有高的表达水平。此外，在干旱、盐、甲基紫精（MV）和ABA处理下，BBX18的表达在0.5h迅速下降，此后被连续诱导。然而，在这些处理下，BBX18在M82中的丰度都在6h最高，而在潘那利番茄中在1h即达到峰值。这些结果说明BBX18在非生物胁迫响应中起初始负调节因子，同时也强调了BBX18在两种基因型番茄中的不同响应模式。

接着，为了研究BBX18在抗旱性中的作用，研究构建了SpBBX18-OE、SlBBX18-RNAi和SlBBX18-CR转基因番茄并对它们进行干旱处理（图3a-b）。结果显示，RNAi和CR敲除系的番茄植株抗旱性显著提高，而OE系的植株对干旱胁迫更为敏感。同时，田间实验也发现bbx18突变系的番茄产量在缺水条件下比WT的产量更高。这些结果说明BBX18负调节番茄抗旱性。

此外，在干旱胁迫后，脯氨酸（Pro）和抗坏血酸（ASA）含量、POD、CAT和APX的酶活都有所提高，且CR系中的这些生理指标高于WT，而OE系低于WT，AAO活性则表现相反。然而，在水分充足条件下，各系番茄中的生理指标几乎没差别（图3c）。这进一步证实了BBX18在番茄抗旱性中的负作用。

图3. 不同BBX18表达水平的转基因番茄抗氧化物含量和胁迫反应酶活性

BBX18与抗坏血酸过氧化物酶1（APX1）相互作用

为了阐明与BBX18有关的抗旱性分子机制，研究利用SpBBX18全长蛋白进行IP-MS和酵母双杂交（Y2H）筛库实验以获取与BBX18相互作用的蛋白质，同时利用STRING数据库验证这些相互作用。IP-MS和Y2H筛库分别为BBX18找到了269和270个候选相互作用蛋白，综合两部分的结果发现这些互作蛋白都参与氧化还原稳态通路、转录调控通路和转录后调控通路。尤其是APX1，它在两个实验中都被发现与BBX18互作（图4）。

图4. BBX18介体复合网络的相互作用

随后，双分子荧光互补（BiFC）、Y2H点对点和CoIP实验被进一步用作证实SlBBX18或SpBBX18与SlAPX1之间的相互作用。结果表明，BBX18的N端双B-box结构域负责特异性与APX1相互作用，而C端CCT结构域没有相互作用。相反，APX1的C端区域负责与BBX1互作（图5b）。

此外，体外酶活测定发现，当SpBBX18存在时会显著抑制重组APX1的抗坏血酸过氧化物酶活性。这些发现为BBX18与APX1结合导致APX活性降低的假设提供了支持。

图5. BBX18与SlAPX1的体内和体外相互作用

BBX18直接负向调控APX1的表达

作为一个TF，BBX18可能结合下游基因的启动子，为了确认其潜在结合位点，研究以过表达带HA标签的BBX18转基因植物进行了ChIP-seq。BBX18可能与一些特定的顺式作用元件结合，比如GGRCCM（C1）、CACDTG（C2）、GAAARWGA（C3）、ATTTAWT（C4）等（图6a），除C2外其他均是已报道的BBX蛋白结合基序，暗示了实验结果的可靠性。此外，研究共获得1033个受BBX18调控的潜在靶基因，它们参与DNA结合和转录调控以及其他各种调控途径，凸显了BBX18在植物中的关键功能（图6b）。

BBX18-OE、BBX18-RNAi和WT植物被用作RNA-seq以进一步研究BBX18的作用机制。在正常生长条件下，BBX18-OE或BBX18-RNAi和WT之间只有极少的差异表达基因（DEGs）。然而，在干旱处理后，DEGs的数量急剧增加。整合ChIP-seq和RNA-seq数据发现APX1、BBX3和BBX24是BBX18的潜在靶基因，ChIP-qPCR证实了它们的结合（图6c-d）。

图6. SpBBX18结合的顺式调控元件的鉴定

有趣的是，BBX18负调节APX1和BBX24而正调节BBX3的表达。此外，EMSA结果显示BBX18可以直接与C3顺式作用元件结合。APX1启动子中有两个C3元件，一个位于ChIP-seq鉴定的峰内。为了确认BBX18对APX1的调节作用，研究构建了不同APX1启动子截短报告基因以及不同BBX18蛋白的截短体效应子进行双荧光素酶报告基因实验（图7a-b）。结果显示，BBX18的C端通过C3元件抑制APX1的启动子活性（图7c）。

此外，Y1H和EMSA进一步证明BBX18的C端是负责与APX1启动子的C3顺式元件结合的蛋白质结构域（图7d-e）。

图7. BBX18与APX1启动子的结合及BBX18 C端的转录激活活性

SlAPX1正调控番茄抗旱性并受BBX18调控

鉴于上述发现，APX1可能是对番茄抗旱性有重要作用的一个基因。研究构建了稳定过表达SlAPX1转基因番茄，其抗旱性相较于WT显著增强。然后，为了弄清楚BBX18与APX1在植物抗旱性中的遗传互作及其调控关系，研究对bbx18、APX1和apx1植株进行了遗传杂交实验。在对F2代进行基因分型后，获得了同时携带纯合子bbx18、APX1和apx1位点的植株。

选择的植株在生长培养基上通过甘露醇处理模拟干旱条件。结果表明，bbx18/APX1-OE植株与bbx18植株的抗旱性无显著差异，但高于APX1-OE植株，同时这些转基因植株的抗旱性都高于WT的（图8a-b）。类似的结果也出现在不同品系的植株进行从截水到土壤的干旱处理中（图8c-d）。

值得注意的是，与bbx18和WT相比，bbx18/APX1和APX1-OE植株中APX1基因的表达和APX酶的活性均有所升高，而bbx18和WT中的APX1表达无显著差异。然而，bbx18/APX1和bbx18植株的APX酶活性显著高于APX1-OE植株（图8e）。此外，与apx1相比，bbx18/apx1双突变体的抗旱性得到恢复，支持BBX18对APX1的调控作用。这些研究结果说明SlBBX18调节APX酶的活性，但不影响APX1基因的表达。

图8. SlBBX18和SlAPX1不同表达量转基因番茄品系的抗旱性

基于上述发现，此研究提出了BBX18与APX1互作调控番茄抗旱性和干旱敏感性的工作模型（图9）。野生番茄（Solanum pennellii）比栽培番茄（S. lycopersicum）更耐干旱的原因，是野生番茄的BBX18（SpBBX18）基因编码一个全长TF，而它在栽培番茄中的同源基因（SlBBX18）因为265位的一个单核苷酸突变引入了一个终止密码子导致翻译提前终止形成了N端截断蛋白。SpBBX18的C端具有抑制APX1基因表达的转录抑制活性。在野生番茄中，SpBBX18结合APX1启动子中的两个串联C3顺式元件并抑制其基因表达。然而，在栽培番茄中，由于缺乏C端的转录抑制活性，SlBBX18允许APX1正常表达。SlBBX18的N端与APX1的相互作用降低了其抗坏血酸过氧化物酶活性，从而使栽培番茄对干旱胁迫敏感。

图9. BBX18与APX1互作调控番茄抗旱性和干旱敏感性的工作模型

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