NC | 浙江大学周杰教授团队整合ATAC-seq和RNA-seq挖掘调控番茄耐冷性的WRKY34并证明其分子作用机制和遗传变异

文摘 2024-10-01 09:30 法国

基因功能分化，主要由突变、基因复制和基因丢失驱动，是进化过程的基础。突变可发生在基因编码区直接改变蛋白质功能，或者发生在顺式调控区影响基因的表达模式。转录调控的进化创新通常源于顺式调控区域的变化，在顺式调控区域中，大量与转录因子直接结合的序列提供了改变基因表达和表型的重大突变潜力。

冷胁迫对作物构成重大威胁，导致作物生长减少、发育受损和产量降低。番茄是十分重要的经济作物，在全球范围内广泛栽培。不同的野生番茄具有不同程度的耐寒性，多毛番茄（Solanum habrochaites, SH）是最耐寒的野生番茄之一。尽管已知番茄在进化过程中耐寒性降低，尚不清楚这背后的遗传机制是否涉及重要基因的顺式调控区域变化和调节作用。

2024年8月6日，浙江大学周杰教授团队在国际著名学术期刊Nature Communications上发表题为“Loss of cold tolerance is conferred by absence of the WRKY34 promoter fragment during tomato evolution”的研究论文。研究整合ATAC-seq和RNA-seq数据分析挖掘了一个冷响应基因WRKY34。

WRKY34启动子中的一个60 bp的Indel导致其在番茄群体中的转录和耐寒性差异。染色质重塑复合物SWIBs和转录因子GATA29通过结合60 bp Indel中的顺式作用元件协同抑制WRKY34在冷胁迫下的表达。此外，WRKY34还通过转录和蛋白水平干扰CBF冷反应通路。此研究结果强调了顺式调控区域的多态性及其在作物进化过程中对染色质结构和基因表达的影响的重要性。

整合ATAC-seq和RNA-seq分析挖掘番茄冷响应基因WRKY34

研究以冷敏感的栽培番茄（S.lycopersicum）AC和耐寒性野生番茄（S.habrochaites）LA1777为材料，冷胁迫处理（4℃,6h）后进行ATAC-seq和RNA-seq分析，正常条件（25℃）为对照。冷胁迫下AC和LA1777的染色质可及性都降低了，但LA1777的可及性还是强于AC（图1a）。

冷胁迫下LA1777和AC之间的差异染色质可及性峰（DACPs）相关基因、LA1777在冷胁迫下相对于正常条件染色质可及性峰增加的基因、冷胁迫下LA1777中的差异表达基因（DEGs）和AC中非显著DEGs的Venn分析发现了18个基因（图1b），它们可能参与形成或调控两种番茄的差异耐冷性。

有趣的是，这18个基因中，仅有WRKY34这一个基因的3kb的启动子在冷胁迫下的两种番茄中存在差异可及性区域，在冷胁迫下的LA1777中出现上调染色质可及性峰。然而，WRKY34的转录和蛋白水平在AC中受冷胁迫的影响较小，在LA1777中显著下调（图1c, d）。这说明转录因子WRKY34可能负调节番茄耐寒性，其启动子中可能存在转录抑制因子的结合元件。

图1. 结合ATAC-Seq和RNA-Seq分析WRKY34在栽培番茄和野生番茄低温胁迫后的表达模式和蛋白积累差异

WRKY34负调控番茄耐冷性

栽培番茄SlWRKY34和野生番茄ShWRKY34是一对等位基因，为了确认它们的功能，研究引入了携带ShWRKY34的S.habrochaites渐渗系LA3942，以及它的轮回亲本S. lycopersicum LA4024和供体亲本S. habrochaites LA1777，并沉默了WRKY34。LA3942和LA1777中的ShWRKY34在冷胁迫后相比与正常条件表达量显著下降，而LA4024中的SlWRKY34在冷胁迫前后没有变化（图2a）。

正常条件下，各转基因植株没有明显的表型差异。然而，在冷胁迫下，与沉默对照相比，沉默SlWRKY34的LA4024、沉默ShWRKY34的LA3942和LA1777都表现出耐寒性增强（图2b），且LA3942和LA1777的耐寒性更强，这体现在冷胁迫下的相对电解质泄漏（REL）更低、光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）和存活率更高上（图2c-d）。

此外，冷响应基因CBFs和CORs在冷处理后被显著诱导。尽管在转基因的LA3942和LA1777中，相对于它们的对照植株，CBFs和CORs并无明显差异，但冷胁迫下它们的表达还是高于在LA4024中的（图2e）。这些结果说明SlWRKY34不响应冷胁迫但负调控栽培番茄的耐冷性，而ShWRKY34在野生番茄和拥有较强耐寒性的ShWRKY34渐渗系中负响应冷胁迫。

图2. 栽培番茄和野生番茄中WRKY34等位基因响应冷胁迫的功能鉴定

启动子中60 bp的InDel对WRKY34受冷抑制至关重要并在番茄种质中存在普遍变异

尽管WRKY34在不同番茄种质中赋予的耐寒性有差异，但6个不同品种番茄中的WRKY34在蛋白层面上并无大的差异。这说明是WRKY34在冷胁迫下的表达模式差异，而不是它们的蛋白质功能，决定了野生和栽培番茄耐寒性的差异。

与栽培番茄的SlWRKY34启动子相比，野生番茄中ShWRKY34在ATG上游的-2315 bp处存在一个60 bp的插入（图3a），恰好位于LA1777中ShWRKY34在冷胁迫下的开放染色质区域，该InDel中包含W-box和GATA-box两个顺式作用元件。

在烟草叶片中利用双荧光素酶（LUC）实验对SlWRKY34启动子插入60 bp InDel和只含GATA-box的30 bp Indel、ShWRKY34启动子突变W-box或GATA-box的组合进行转录活性分析（图3c），确认了是ShWRKY34而不是SlWRKY34启动子受冷胁迫抑制，GATA-box对这种作用至关重要。

有意思的是，在一个由181份栽培番茄、74份樱桃番茄、58份醋栗番茄和63份野生番茄组成的群体中，所有栽培番茄、樱桃番茄、醋栗番茄和2个野生番茄种中都无60 bp插入，而60 bp插入存在于91.4%的野生番茄中（图3d-e）。含有60 bp缺失的WRKY34变体在冷胁迫后表达无显著变化，而插入60 bp的WRKY34变体在冷胁迫后表达显著下降（图3f）。

这些结果表明所有野生和栽培番茄中60 bp的InDel与冷抑制WRKY34的表达显著相关，并且WRKY34启动子中的60 bp插入在野生番茄中普遍存在，但在向醋栗番茄的进化过渡中逐渐消失。

图3. WRKY34启动子中的60 bp InDel导致WRKY34在冷胁迫下的不同表达模式

SWIBs和GATA29直接结合WRKY34启动子的60 bp InDel片段

接下来，研究利用酵母单杂交（Y1H）筛选出GATA家族转录因子SlGATA29以及染色质重塑复合物SlSWIBa和SlSWIBb可能与60 bp InDel相互作用。一系列分子互作实验，诸如全长序列的Y1H、电泳迁移迁移（EMSA）和微尺度热泳（MST）进一步证实SlGATA29和SlSWIBa/b依赖GATA-box结合60 bp InDel（图4a-b,d）。

RoseTTAFoldNA用于预测复合物模型，发现SlSWIBa和SlSWIBb中的Arg6，SlSWIBa和SlSWIBb中的Leu46和Leu44，SlSWIBa中的Lys88和SlSWIBb中的Lys86，可能通过氢键与60 bp InDel结合（图4c）。MST和Y1H结果显示，三个氨基酸同时突变而不是只突变其中一个才会影响SlSWIBa/b与60 bp InDel结合（图4e）。

尽管SlSWIBa/b可以和60 bp InDel结合，但它们不直接调控WRKY34的启动子活性（图4f）。此外，只有在GATA-box存在时，SlGATA29才抑制WRKY34的启动子活性。在体内，由于缺少60 bp InDel，SlGATA29和SlSWIBb均不能与LA4024的SlWRKY34启动子结合。SlGATA29在正常条件下不能与LA3942的ShWRKY34启动子结合，但在冷胁迫下可以与其启动子结合（图4h）。

然而，在常温下，SlSWIBb可以直接结合LA3942的ShWRKY34启动子，冷胁迫后结合进一步增强。此外，LA3942背景下SlGATA29或SlSWIBb的过表达抑制了冷胁迫下ShWRKY34的表达，而LA4024背景下SlWRKY34的表达对冷胁迫没有反应（图4i）。这些结果说明GATA29通过60 bp InDel直接结合并抑制WRKY34的启动子活性，而SWIBs可能需要与其他蛋白一起才调控WRKY34的转录。

图4. SlGATA29和SlSWIBa/b直接与WRKY34启动子的60 bp InDel结合并在冷胁迫下抑制WRKY34的表达

SWIB和GATA29通过60 bp InDel片段协同抑制WRKY34的表达

染色质重塑因子通常通过特定的转录因子募集到靶基因，从而协同调节靶基因的表达。此研究通过酵母双杂交（Y2H）、谷胱甘肽下拉（GST-pull down）、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验证明SlGATA29在体内和体外均与SlSWIBa和SlSWIBb相互作用（图5a-d）。这种相互作用还会增强对下游靶基因WRKY34含GATA-box启动子片段的转录抑制，除了pSlW34^+30bp（图5e）。

有趣的是，在LA3942背景下过表达SlGATA29会观察到显著的SlGATA29结合ShWRKY34启动子且ShWRKY34的表达量在冷胁迫下显著降低，而共同沉默SlSWIBa和SlSWIBb会减少这种结合并缓解WRKY34在冷胁迫下的表达下降。然而，在SlWRKY34启动子缺失60 bp InDel的LA4024中没有这种现象（图5f-g）。此外，通过EMSA实验并未观察到添加SlSWIBa或SlSWIBb会增强SlGATA29对60 bp InDel的结合。这些结果表明，SlSWIBs可能通过染色质可及性（真核环境+60bp InDel）增强SlGATA29对WRKY34表达的抑制作用。

图5. SlSWIBa/b和SlGATA29协同抑制WRKY34表达

SWlB和GATA29通过60 bp InDel影响染色质可及性和耐冷性

为了进一步阐明SWIBs对WRKY34启动子60 bp InDel片段相关染色质可及性的影响，研究在LA4024或LA3942背景中构建了SlSWIBb过表达系和slswibab双突变体并对它们进行了ATAC-qPCR。结果显示，在LA3942背景下，WRKY34启动子60 bp InDel片段周围的区域在冷处理后染色质可接近性增加，过表达SlSWIBb增加了该区域的可及性并在冷胁迫下更易接近，而双突变slswibab使该区域丧失了冷诱导的染色质可及性。此外，在LA4024背景下，该区域始终无冷诱导的染色质可及性，无论SlSWIBs存在与否（图6a）。

与染色质可及性一致，WRKY34在LA4024背景下的表达不响应冷胁迫。然而，在LA3942背景下，WRKY34的表达在冷处理后显著降低，过表达SlSWIBb增强了冷胁迫对WRKY34的抑制作用，而双突变slswibab使冷胁迫的抑制作用丧失（图6b）。相应的，SlSWIBs存在与否对LA4024的耐寒性没有影响，而在LA3942背景下过表达SlSWIBb或双突变slswibab分别导致耐寒性增加和降低，体现在REL、Fv/Fm和存活率指标的变化上（图6c-e）。

有意思的是，对GATA29的转基因操作取得了与SWIBs相似的结果，这些结果表明60 bp InDel是SWIBs介导的冷诱导染色质可及性增加、WRKY34表达量降低和抗寒性增强必需的。突变60 bp InDel中关键的GATA-box元件使冷诱导的染色质可及性增加丧失（图6f-g），WRKY34受冷抑制作用解除，对冷胁迫的敏感性也增强。

图6. SlSWIBa/b增强WRKY34启动子的染色质开放以提高番茄的耐冷性依赖于60 bp的InDel

WRKY34在转录和蛋白水平上破坏CBF-COR冷反应途径

沉默WRKY34可影响冷胁迫后LA4024中CBFs和CORs的表达（图2e）。不仅如此，SlWRKY34还可以与SlCBF1相互作用（图7a-d），反映出WRKY34对CBF-COR冷反应通路的影响。SlCBF1在体外可以直接结合SlCBF1和SlCOR47启动子中的DRE元件，但这种结合作用会被添加SlWRKY34削弱（图7e）。同时，共转染SlWRKY34和SlCBF1还会减弱SlCBF1对自身和SlCOR47的转录激活（图7f）。此外，在slwrky34突变体中沉默SlCBF1会显著降低突变体在冷胁迫下的耐寒性，具有更高的REL和更低的Fv/Fm（图7g-i）。

此外，SlCBFs和SlCOR47启动子中还有许多W-box元件。Y1H、ChIP-seq和双LUC实验证实SlWRKY34通过直接结合SlCBFs和SlCOR47启动子从而抑制它们的转录。这些结果说明SlWRKY34一方面直接抑制CBF-COR通路基因的转录，另一方面通过与SlCBF1相互作用减轻其对自身和SlCOR47的转录激活间接影响CBF-COR通路，WRKY34在转录和蛋白两个水平上破坏CBF-COR冷反应途径。

图7. SlWRKY34干扰SlCBF1的转录活性从而降低番茄幼苗的耐寒性

基于上述发现，研究提出了WRKY34介导的野生和栽培番茄耐冷性的工作模型（图8）。在冷胁迫下，野生番茄S. habrochaites的WRKY34启动子中60 bp插入的存在，导致染色质重塑因子SWIBs结合，从而打开附近区域的染色质，招募转录抑制因子GATA29与60 bp内的GATA-box结合，从而抑制WRKY34的表达。WRKY34通过与CBF1相互作用干扰CBF1诱导的自身和CORs表达。此外，WRKY34直接结合下游CBFs和CORs的启动子并抑制其在冷胁迫下的表达。然而，栽培番茄WRKY34启动子中60 bp DNA片段缺失，导致其在冷胁迫下无法结合SWIBs，阻止染色质打开和GATA29的招募，从而无法抑制WRKY34的表达，导致这些番茄的冷敏感性。

图8. WRKY34介导的番茄耐冷模型

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